【心得】如何做成为PCR高手

PCR 的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来，
与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。。
一、 引物设计
所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。设计软件有很多，既可
以在线设计如Primer3.,
http://frodo.wi.mit.edu/
也可以用Primer5、Oligo6.0等等。到哪找？别着急，咱论坛里有，用起来有什么问题也可以到论坛里问问：
有了软件就该讲讲怎么设计了：
1. 引物设计的原则
细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：
1. 典型的引物18 到24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2. 选择GC 含量为40％到60％或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。
3. 设计5'端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交
的稳定性。
4. 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时,PCR 产率可达100%, ? G=-6 时,为40%.
5. 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T。
6. 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾，防止AT 的松散结合引起错配。
7. 避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
8. 引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。两引物的Tm 值相差不应大于5℃。计算Tm 有几种公式。第一个公式(Wallace 规则):Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T）,这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于15-20个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式(Baldino 算法)适用于计算14-70个核苷酸在≤0.4mol\L 的阳离子溶液中的Tm, 也可用于扩增产物的Tm 计算.Tm=81.5+16.undefinedlg[K+]+0.41(%[G+C])-(675/n)。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排
列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm 可能差异不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一样的，所以确定引物Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序如Primer5 等均使用近邻分析法。
9. 当在引物5’端添加酶切位点时要考虑：a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的，关于这一点，论坛里讨论过好几次了，到用“保护碱基”为关键词搜索一下吧。如果不设计保护碱基，则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择，这一点在后面再聊。若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和
内部二级结构的检测。
10. 有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。特别要注意的是：不要在引物的3'端使用兼并碱基，因为3'端最后3 个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引
物浓度（1μM 到3μM），因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
说了半天了,想起来还得提醒大家一句:千万别搞错了引物的位置！这句话似乎多余,可是事实上,在论坛中不时能看到一些朋友一不小心就犯错!
看了上面的图吧,如果要扩增目的序列为”ATG⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯TGA”的片段，则引物分别为“ATG⋯⋯⋯⋯”和“TCA⋯⋯⋯⋯”仔细琢磨一下，特别是5’端再接上酶切位点可别搞错了！合成错了一条可就是50 块钱，到时候挨老板批的时候别怪我没提醒你哦：）设计好了引物就要让公司合成，这时候别忘了谈价格：）现在竞争很厉害，价格已经挺便宜了，注意两个参数：一个是OD 值，如果公司说1OD 能比2OD 优惠，那通常1OD 足够了。第二是纯度，是HPLC 的还是OPC 的，事先要说好，建议看看这里（唉，不是我给他们做广告，只是他们的说明书写得真不错）：
http://www.takara.com.cn/product/cs/c_3.htm#1
引物设计方面还有很多话题可说，比如如何利用引物搭桥将两个片段通过PCR 而不是酶连接起来、如果要设计引物表达蛋白时注意“N 端规则”⋯⋯
二、 PCR 成分
引用《分子克隆3》提供的PCR 标准反应条件：
模板 1pg-1μg
引物 1μmol/L
DNA 聚合酶 1－5 单位
Mg2＋ 1.5mmol/L
dNTPs 200μmol/L
KCl 50 mmol/L
1. 模板
模板可是PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件，巧妇难为无米之炊嘛！怎样得到模板，这可是一个大问题，仅仅一个提取基因组DNA 就有很多的名堂，这会是我们后面专辑的内容，这里不多说啦，有问题来论坛讨论吧。P 不出东西的时候不妨先考虑：模板有没有问题？（DNA 样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA 制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。）所需的最佳模板量取决于基因组的大小。你的目的片段在基因组中占多少？至少要保证模板中含有一个单拷贝吧！100ng 到1μg 的人类基因组DNA，相当于3×104 到3×105 个分子。
所以对于单拷贝基因,这需要0.1μg 的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng 的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
2. 引物
引物以干粉形式运输。最好用TE 重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE 比去离子水好，因为水的pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解。当然，如果担心TE 对于PCR 的影响，不妨用ddH2O。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM 浓度溶于TE 的引物在-20℃可以稳定保存6 个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1 周。干粉引物可以在-20℃保存至少1 年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2 个月。
注意：溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了。
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1 到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。通常跟着引物来的说明书会告诉你，关于寡核苷酸的计算可以看看这里：
http://www.takara.com.cn/product/fl/i_1.htm
3. 聚合酶的选择
这可是有讲究，咱论坛里有个专题讨论这个问题。主要考虑两个方面：用途——对保真度的要求高不高？成本——高保真的酶总是会贵一些的。综合考虑一下找个平衡点吧，当然啦，该花钱的时候可不能省。Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3'到5'外切核酸酶（校正）活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。
但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述，大家不妨比较一下。提醒一点：高保真酶除了我所知的Merck的Easy-A 以外，都不会在3’端加A尾巴（因为其3’-5’外切酶活性），所以做TA克隆的时候需要一点小诀窍——扩增完了再加普通Taq去加个A。另外还有个方法：将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩
增长模板。
4. Mg2＋浓度
镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性（当然，
也有相反的报道）。为了确定最佳浓度, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。