RT-PCR一些心得
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从RNA到电泳鉴定
一、RT-PCR原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA 为模板，用VI 型胶原蛋白的α1 链的编码序列的特异性引物进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA 探针、构建RNA 高效转录系统。
1）随机六聚体引物：当特定mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：是一种对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA 可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3）特异性引物：用含目标RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。缺点是只能用于单一基因的PCR实验。
二、引物设计
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用ΔG 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex ormation and hairpin）的能值，在错配位点（ false priming site ） 的引发效率， 引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料[24]，引物设计应注意如下要点：
1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3）引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4）引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。
5）引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。
6）ΔG 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8）对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列。
三、总RNA提取
如果使用试剂盒，则根据kit的使用说明就可以。也可使用传统的单试剂方法。但是需要注意以下几个问题。
注意RNA的降解：RNA降解的可能性很大，但是并不可怕。书上要求塑料耗材需要用DEPC浸泡过夜后高压灭菌。如果使用的是一次性的塑料耗材，可以直接高压灭菌用于实验。使用的蒸馏水需要配成0.1%DEPC水过夜后高压灭菌。操作过程，尽量不要交谈，可以不带口罩。
注意DNA的污染：细胞裂解后离心，取样时需要小心，只能取上清夜，如果取到中间层则可能引起DNA的污染。
RNA完整性的鉴定：一般我们使用的是琼脂糖凝胶电泳。由于我们使用的是公共设备，电泳槽及缓冲液中含有RNAase，所以需要用洗衣粉彻底清洗，并换新配置的TAE/TBE。否则会将电泳过程造成的讲解误认为是提取RNA过程中的降解。
四、逆转录
一般使用的是2步法。逆转录反应和聚合酶链式反应。使用试剂及耗材：
AMV或使用MMLV，我们实验一般使用的是AMV，MMLV用于扩增长片段，AMV扩增长度一般小于2000bp。AMV价格在300元左右（200U），一次使用5U；
RT-buffer 10× 购买时AMV配送；
RNAase Inhibitor:50U/50ul体系 使用的浓度为10U/ul 1000U价格在120左右；
Oligo dT18 公司合成 合成价格（1.5元/bp 生工）；
dNTP 10mM 配置后的浓度为200μM。价格一般为80元/ml
以下是配置50ul反应体系，配置体系的大小根据后续实验需要的cDNA的量来决定：
Oligo dT-----------------------3 ul
Total RNA--------------------7 ul
RT-buffer----------------------5 ul
dNTP--------------------------2 ul
RNAase-I---------------------5 ul
3dH2 O---------------------27.5 ul
AMV------------------------0.5 ul
total 50 ul
取一支PCR管，加入7ul的Total RNA （根据RNA 浓度决定）和3 ul的Oligo dT ，在水浴锅中70 ℃10 分钟使之充分变性。然后取出PCR 管并放入冰块中10 分钟，骤冷退火。使Oligo dT 与mRNA 配对结合。然后加入3dH2 O 、RNAase-I- 、dNTP 、RT-buffer ，最后加入AMV 。42 ℃延伸40 分钟（如果mRNA 有复杂的二级结构，延伸中途可以将PCR 管重新放到70 ℃水浴）。最后94 ℃灭活AMV。即得到所有mRNA的cDNA。mRNA只占总RNA的1-5%。
五、聚合酶链式反应
以下是配置50ul反应体系，配置体系的大小根据后续实验需要的目的DNA的量来决定。反应体系不能简单乘以倍数。
引物稀释：n 摩尔数×200= 稀释体积（µl ）
cDNA----------------------------2µl
dNTP-----------------------------1µl
10 ×PCR-buffer---------------5µl
上引-----------------------------1µl
下引-----------------------------1µl
Taq--------------------0.5µl(2.5U)
3dH2 O------------------------39.5µl
Total 50µl
Taq 一般60 元/500 单位 10 ×PCR-buffer 和 6 ×loading buffer 均有配送。
注：所有塑料耗材高压灭菌，55 ℃干燥。实验中勤换枪头，最好吸一次换一次。避免试剂的交叉污染。注意移液枪是否吸有试剂，吹打是否完全。否则以为加了试剂，其实没有加到足量的试剂，影响反应体系。
建议：实验中先加3dH2 O ，即方便加试剂又容易是试剂混合，最后加Taq 。如果增加特异性性可以使用巢式PCR 或Touch down PCR ；如果需要测mRNA 需要使用3’race(rapid amplification of cDNA ends) 和 5’ race 。
六、电泳鉴定
电泳试剂及步骤详见研究进展之六
使用不同的marker和目的条带的大小选择合适的凝胶浓度。浓度太小则marker跑不开。如果两个条带相差不大也跑不开。EB浓度不要太大否则成像时背景噪音污染较大。成像时载物台的保鲜膜不要太皱，否则图像很难看。
电泳时电压不宜过大，电压<5V/cm。我们一般使用100V电压,跑胶时间不能太长，否则会跑跳海一般30－40分钟。溴酚蓝的位置在500bp左右，可以根据溴酚蓝的位置判断跑胶是否完成。
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