SYBR G的一些心得
丁香园论坛
2093
做了快一年的SYBR G的定量实验了,有一些心得,写出来大家交流下.
也是今天在学校的BBS上有人推荐这里的,觉得很不错.
我们用的机器是ABI 7900,我自己比较喜欢的试剂是ABgene的QPCR sybr ROX MIX.
undefined试剂我一般再进行稀释一倍后使用,反应总体系是10ul.
用SYBR G来做的话,引物非常重要.
我设计引物使用Primer 5,一般选择上游引物跨最后和最后第二个外显子,下游引物在最后一个外显子中,实在找不到,可以前移,但是一定保证至少一条引物跨外显子。跨外显子有个很大的好处，就是如果你拿到引物后，可以用DNA来做下子看看，如果扩不出来，那么抽完的RNA就可以不用DNA酶处理，直接反转录了。（说实话，一般DNA酶处理的时候，RNA也会伤血的，所以不处理的话，RNA本身也会快乐很多）
设计好后绝对不能有杂带,dimer可以容忍,但是AG不能低过-6.0.
满足了这些条件后,Tm值两条引物要统一在60度,可以在5'末端加一两个碱基的错配进行引物温度的均一化.
设计完要记录下产物的长度和Tm值,用于以后核对.一般产物的Tm值在85到90左右比较好,太低的话会和引物二聚体的峰混,太高变性不完全.
反应时引物浓度不能很高,太高的引物浓度很容易引起引物二聚体,很伤的.关于去引物二聚体的峰,有些仪器公司会推荐用户在做融解曲线的时候适当提高复性温度。这个其实非常不赞的，无论是从技术上还是人品上。从技术上来讲，实际上目的基因copy数不同，temp与DIMER竞争引物的效率也是不同的，也就是说当temp成比例增加的时候，dimer一般会有一定程度的减少，而由于SYBR G的特性，导致即使temp的量有改变，在Rn上也不一定能看出来。从人品上来讲，虽然那张融解曲线图虽然很美，但是未免有凑结果的感觉。
言归正传，引物浓度ABgene是推荐70nM，我现在一般50-100nM都有做。
然后说temp的浓度，temp的浓度显然不是越浓越好的，我曾经做过的一个实验是要检测基因在genomic DNA上的copy数，直接加了20ngDNA来做，做出来结果很差。后来就把DNA做了稀释梯度来做，发现奇了怪了，怎么越稀释，Ct反而越靠前了。想了很久，想明白了如果模板太多，在复性的时候铁定模板先吃到SYBR，等差不多产物快复性了，SYBR已经被模板吃完了，只有产物积累到一定程度才有力气和temp抢SYBR吃，这个时候也就是我们看到的起跳点。
所以说其实temp的量是一定要控制的，我们做10ul体系，放个1ng-3ng是足够了（双波长检测结果），或者如果是用ABI系列来做的话，看下baseline的信号，一般在500左右差不多，再低到100也能做得出来，千万不可以超过5000，肯定会死人的。
有句题外话：我为什么老觉得双波长测出来的值会比电泳高出5-10倍呢？
继续说反应条件，根据不同的试剂来设激活温度的时间长短，ABgene的酶是15min，ABI的是10min。通常情况都是两步法，95度15s，60度1min，然后加融解曲线。7900做出来的融解曲线峰比Primer 5的温度大约低2-3度。
标准曲线的问题。我现在用以前做完的PCR产物来做标准曲线，结果还是很不错的，斜率一般在-3.2-3.4之间，拟合度一般都在0.99以上。
会有人说用cDNA或者质粒做标准曲线会更好，曾经有人过来我们这里做，更希望说要把每个基因都设一条标准曲线，其实这个是完全没有必要的。理想的PCR反应扩增效率都是接近于1的，而标准曲线作为外参能达到这个水平就可以了，用什么模板用什么引物都无所谓的。关键是要保证自己的引物好，模板好。
好了，现在能想得起来的就是这些，以后想到什么再加上。
也是今天在学校的BBS上有人推荐这里的,觉得很不错.
我们用的机器是ABI 7900,我自己比较喜欢的试剂是ABgene的QPCR sybr ROX MIX.
undefined试剂我一般再进行稀释一倍后使用,反应总体系是10ul.
用SYBR G来做的话,引物非常重要.
我设计引物使用Primer 5,一般选择上游引物跨最后和最后第二个外显子,下游引物在最后一个外显子中,实在找不到,可以前移,但是一定保证至少一条引物跨外显子。跨外显子有个很大的好处，就是如果你拿到引物后，可以用DNA来做下子看看，如果扩不出来，那么抽完的RNA就可以不用DNA酶处理，直接反转录了。（说实话，一般DNA酶处理的时候，RNA也会伤血的，所以不处理的话，RNA本身也会快乐很多）
设计好后绝对不能有杂带,dimer可以容忍,但是AG不能低过-6.0.
满足了这些条件后,Tm值两条引物要统一在60度,可以在5'末端加一两个碱基的错配进行引物温度的均一化.
设计完要记录下产物的长度和Tm值,用于以后核对.一般产物的Tm值在85到90左右比较好,太低的话会和引物二聚体的峰混,太高变性不完全.
反应时引物浓度不能很高,太高的引物浓度很容易引起引物二聚体,很伤的.关于去引物二聚体的峰,有些仪器公司会推荐用户在做融解曲线的时候适当提高复性温度。这个其实非常不赞的，无论是从技术上还是人品上。从技术上来讲，实际上目的基因copy数不同，temp与DIMER竞争引物的效率也是不同的，也就是说当temp成比例增加的时候，dimer一般会有一定程度的减少，而由于SYBR G的特性，导致即使temp的量有改变，在Rn上也不一定能看出来。从人品上来讲，虽然那张融解曲线图虽然很美，但是未免有凑结果的感觉。
言归正传，引物浓度ABgene是推荐70nM，我现在一般50-100nM都有做。
然后说temp的浓度，temp的浓度显然不是越浓越好的，我曾经做过的一个实验是要检测基因在genomic DNA上的copy数，直接加了20ngDNA来做，做出来结果很差。后来就把DNA做了稀释梯度来做，发现奇了怪了，怎么越稀释，Ct反而越靠前了。想了很久，想明白了如果模板太多，在复性的时候铁定模板先吃到SYBR，等差不多产物快复性了，SYBR已经被模板吃完了，只有产物积累到一定程度才有力气和temp抢SYBR吃，这个时候也就是我们看到的起跳点。
所以说其实temp的量是一定要控制的，我们做10ul体系，放个1ng-3ng是足够了（双波长检测结果），或者如果是用ABI系列来做的话，看下baseline的信号，一般在500左右差不多，再低到100也能做得出来，千万不可以超过5000，肯定会死人的。
有句题外话：我为什么老觉得双波长测出来的值会比电泳高出5-10倍呢？
继续说反应条件，根据不同的试剂来设激活温度的时间长短，ABgene的酶是15min，ABI的是10min。通常情况都是两步法，95度15s，60度1min，然后加融解曲线。7900做出来的融解曲线峰比Primer 5的温度大约低2-3度。
标准曲线的问题。我现在用以前做完的PCR产物来做标准曲线，结果还是很不错的，斜率一般在-3.2-3.4之间，拟合度一般都在0.99以上。
会有人说用cDNA或者质粒做标准曲线会更好，曾经有人过来我们这里做，更希望说要把每个基因都设一条标准曲线，其实这个是完全没有必要的。理想的PCR反应扩增效率都是接近于1的，而标准曲线作为外参能达到这个水平就可以了，用什么模板用什么引物都无所谓的。关键是要保证自己的引物好，模板好。
好了，现在能想得起来的就是这些，以后想到什么再加上。
