降落 PCR 的常见问题有哪些？

一、提问：降落 PCR（Touchdown PCR）的原理？

回答：

Touchdown PCR 是指每隔一个循环降低 1°C 反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行 10 个左右的循环。该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环 PCR 产物量的两倍差异（每摄氏度造成 4 倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集该方法的另一个应用是在确定已知序列肽的 DNA 序列。

具体过程如下：

使用两套与已知序列肽两末端可能配对的简并引物，这只需要知道一段长为13 个氨基酸的肽段序列，5’ 和3’ 引物各长 18 个碱基（6 个氨基酸），两者之间有一个碱基以上的间隔。使用简并引物即可以进行“Touchdown PCR”。由这种方法将获得大量的产物，但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离，所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。如果克隆和测需一打 PCR产物，将可以确定肽的正确编码序列，设计进行杂交的寡核苷酸等。该技术特别适用于由Ser，Lys 和 Arg（每个有6个密码子）构成的多肽。

二、提问：降落 PCR 的优点？

回答：

综合比较普通 PCR 技术和最大耐受量聚合酶链反应，认为前者程序简单，省时，一般的 PCR 扩增仪都可完成，但缺点是退火温度不适当时容易出现假阳性;而最大耐受量聚合酶链反应虽然程序复杂，需要扩增仪有较大的内存，但能非常有效地降低或避免假阳性，且不在理想的工作条件（比如最佳镁离子浓度）下也可扩增出产物。

这就是降落 PCR 技术的优点吧。不过我认为。如果能用普通 PCR 技术扩出来的话，尽量用普通的聚合酶链反应，虽然降落聚合酶链反应比较省事省力，但是，它在一个很宽的退火温度里扩增，乱七八糟的条带肯定比较多哈。虽然，电泳可能看不到。

降落 PCR 的一个优点是可以增加某些基因的特异性,不仅我自己在扩基因的艰难历程中,发现了这一优点,而且也推荐给周围的人,如果常规 PCR 循环程序的基因扩增效果不佳,我就来热启动加降落PCR，在非特异性背景较高的情况下,这招的确有效,但不绝对。

三、提问：温度梯度 PCR 功能与降落 PCR 功能的区别？

如：温度梯度 PCR,如 25 个循环的退火温度为 50℃~60℃，40 秒；和降落 PCR 有什么不同之处，退火温度从 60℃~50℃，10 个循环，每个循环降低 1℃；效果是不是都是一样？

回答：温度梯度 PCR 是指在退火温度不太明确时，为了找到最优退火温度，在一台 PCR 仪上同时做多管 PCR，每一管放在仪器内不同列（有的是不同行）上，分别进行 PCR（如50℃~60℃ 可以分 6 管，分别为 50，52，54，56，58，60度），最后看看哪个温度的效果最好。总之是用来进行退火温度优化的。降落 PCR 是在同一个 PCR 管内进行 PCR，只是每个循环的温度不同（如每个循环降1度）。一般兼并引物用这种方法多些。

四、提问：我的两条引物说明书的 Tm 值分别为 69℃、62℃，若用降落 PCR 如何设定温度范围？

回答：这两个 TM 值相差有点大,一般不要超过三度,我认为你的退火温度就在 62,63 度左右,你可以先试试,如果你想做降落 PCR,那么你可以先用高的退火温度做几个循环,然后在换到较低退火温度做几个循环,然后再用更低的温度做剩下的循环,对于你这个,你可以先用 65 度左右做 5 个循环,然后在 60 度左右做 5 个循环,其余在 58 度做剩下的循环,只是经验,不一定能出来。

五、提问：什么情况下需要做降落 PCR？

回答：主要是在出现非特异条带时可以考虑用降落 PCR,在高的退火温度下做几个循环,这样扩出的产物特异性好,可以做为后续反应的模板,然后再温度较低的情况下以前面扩出来的较特异的产物做模板,这样不但特异性好,而且产物也够多,可以出现很好的结果。

还有就是在刚合成引物还未经鉴定效果的时候,可以用降落 PCR ,但是正如上面说的你的两个引物的 TM 值相差的有点大,一般降落是在 TM 值以下 3-5 度开始将,每个循环降 0.5 或 1 度,降差不多十个循环后,再维持在最后一个循环的温度上,不要担心最后的循环数目不够,其实只要模板量没问题，二十个循环足够了。

六、提问：刚合成的引物用降落 PCR 的原因是什么啊？

回答：因为理论计算的 TM 值用来确定退火的温度只是一个参考呀,最合适的退火温度会因为各种原因而有所差异,就连 PCR 仪都会有影响的,我们实验室就是,好多都是在一台能拉出条带,而在另一台上就拉不出条带,或者相反的。

降落（TD）PCR 代表了一种完全不同的 PCR 优化方法。由于开始时的退火温度选择高于估计的 Tm 值，随着循环的进行，退货温度逐渐降到 Tm 值，并最终低于这个水平。此策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异性杂交的 Tm 值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异性）PCR 产物的地位。有人研究发现一些本来产生满意的单一扩增产物的反应采用 TD PCR 时变得更好进行了。

提醒一下，如果说明书上的 Tm 值和 Oligo 或者 Primer 上分析的差别挺大的，你要以软件上的计算为准。 我觉的你两个引物 Tm 值差的太多，不过你也可试。68 度开始，每个循环下降 0.5 度，或者 0.2 度，最后 62 度来个 20 循环。

七、提问：请提供一个标准的 Touchdown PCR 程序。

回答：
ANNEALING TEMP. 55度
94 5min

94 30s
60 30s
72 1min 2cycles

94 30s
59 30s
72 1min 2cycles

94 30s
58 30s
72 1min 2cycles
........

94 30s
51 30s
72 1min 2cycles

94 30s
50 30s
72 1min 20cycles

72 5min

你也可以做 Stepdown
原理同上，就是把降落的梯度增加，以三度为宜。

另一个程序：

94C 4min
94c 5sec
70c 10sec
72c *sec 30个循环，每个循环降0.5c
94c 5sec
55c 10sec
72c *sec 15个循环
72c 7min

延伸时间要看你扩增的片断的长度定，最好先做一个剃度 pcr 测一下退火温度的范围，然后再做 touchdown，这样更有的放矢。