AluPCR:用重复序列引物扩增来源复杂的人DNA

引言

　　聚合酶链反应PCR使不同来源的特异核酸片段的分离及分析发生了革命，但应用PCR分 离，分析特定DNA区域需要了解靶区域的边侧序列，这使扩增局限于已知DNA序列。我 们研究了从复杂的人和其他种DNA混合物中扩增未知DNA序列。特别是，我们应用PCR 分离出了在啮齿类细胞背景中含有人染色体片段的体细胞杂合体中的人DNA。使存留 在杂合子中的人特异区域序列得到分离和鉴定，避免了克隆DNA库和用人特异重复序 列探针他离人序列克隆。我们所用的方法，即AluPCR，也已被证明可从克隆中快速分 离插入的人类DNA，这将PCR的应用扩大到克隆于Lambda和酵母人工染色体(YAC)载体 上的基因组DNA，PCR在大基因组区域上的应用为分析人基因提供了另一个工具。

　　AluPCR方法特点在于利用人DNA中普遍存在的Alu重复序列，这种300bp序列的拷贝约 900.000个，分布于整个人基因组。虽然Alu重复序列各拷贝间有很大差别，但已确定 出了一个相同序列，且重复子中一些区域是极为保守的。我们认为，可设计合适的能 识别这些保守区的PCR引物，进行有效的内-Alu扩增，从复杂源中分离人DNA。为了只 扩增体细胞杂合子中人DNA而不同时扩增啮齿类Alu等位子，我们需要鉴定人特异引 物。

从杂合细胞株中扩增人特异DNA

　　我们合成了大量引物，测试了它们扩增人、体细胞杂合子及啮齿类DNAs的能力。图1 所示为用TC-65和#278两个引物增的结果，#278识别啮齿类DNA扩增啮齿类序列，而 TC-65引物对人DNA物异，从X-3000-11.1杂合细胞株(含Xq24-qter，是人类特有的中 扩增出数目不同的带。值得注意的是，TC-65引物在310bp的灵长类特异的插入区中， 此插入区在人Alu序列的第二个重复子上而#278引物则定位于哺乳类Alu-等位子中高 度保守的重复部分，关于所涉及的反应条件及引物的详细描述，已送出版。

　　下面概述一下我们的发现。序列的扩增量似乎依赖于寡聚核苷酸引物量及在总目的 DNA中人类目的DNA所占的量。最初的有效引物TC-65是含有17个碱基的Alu序列和含一 个NotI酶切点的13碱基5'端外延序列，设计NotI酶切位点是为了克隆扩增的产物。单 独使用TC-65只在方向相反间距5-6kb的Alu序列间进行扩增。但也并不扩增所有这样 的Alu序列时，而是偏向于某些特异的Alu重复子。杂合细胞株X-300011.1表现出这一 现象(图1)，该株中，TC-65引物扩增出的带数在50-100间，该杂合子中含约40Mb人 DNA，认为Alu重复对特异地适合用这种引物扩增。

　　图1.用Alu引物从体细胞杂合子中扩增人DNA。用TC-65引物和#278引物从人， X3000-11.1，仓鼠和小鼠中扩增DNA的PCR结果。每个泳道分别标出了所用引物和DNA 的来源，分子量标准物为λDNA-HindⅢ和X174-HaeⅢ的混合物，PCR反应总体积为 100ml，含1mlDNA，1mM引物，50mMKCL10mMTrispH8.0，1.5mMMgCl2，0.01%明胶， dATP，dCTP，dGTP，dTTP(Pharmacia)各300mM;2.5单位Taq聚合酶，94℃变性(1分种 )，55℃退火(45秒)，68℃延伸(5分钟)，在自动热循环仪(automatedThermalCycler) 中进行35个循环。凝胶为1.1%琼脂糖，电泳缓冲液为Tris-硼酸缓冲液。

　　极为有趣的是我们发现用TC-65引物从X-300011.1细胞株(所有其他杂合株含有人hprt 位点)中扩增的一个序列(3.5kb带)可与hprtmRNA的cDNA探针杂交。在肯定一个真正的 人特异序列被扩增后，该序列也为研究在这个扩增产物中包含的Alu重复序列提供了 机会。为定位hprt基因中的重复子，我们用TC-65引物扩增了整个编码区的6个噬菌体 克隆DNA。其中两个克隆显示出预期的3.5kb带，并能与hprtmRNA的cDNA探针杂交。因 为这些克隆互相重叠，并只含外显子7、8、9，我们估计此序列的Alu重复子引动合成 位置间距3.5kb，方向相反且在基因中跨越上述三个外显子中的一个或更多个。检查 来自这一区域的序列(与W.AnsorgeEMBL/Heidelberg，Edwards合作)已使我们鉴定出 所含的Alu序列。该Alu重复子跨越外显子9，其中一个复制子位于外显子8与外显子9 间的内含子上，另一个在编码区的下游。包含在扩增产物中的下游Alu重复子能与引 物中17个碱基的Alu序列完美互补，但与引物的5'端尾部没有特异的同源性。外显子8 和9间的Alu重复子与引物中17个碱基Alu序列有一个碱基错配，但这可由引物中紧邻 Alu区的尾部中的另外两个配对所弥补，保证了一排中19分之18的同源碱基，该序列 信息会使我们了解TC-65引物扩增的选择性质。更为重要的是鉴定这对可扩增Alu重复 子，可使我们在用其他引物扩增序列的反应中确定重要参数。

　　已发现其他互补于相同区域Alu重复子的引物也能特异地扩增杂合细胞中的人DNA， TC-65引物中17个碱基的互补序列也有用，从杂合细胞人基因区扩增出一组独立片 段。没有尾部的引物有特别的用处，可从给定的DNA源扩增出更多的序列。例如，用 这些引物扩增X-30011.1细胞株，呈现出几百条带的一片，而含较少量人序列(1-2Mb) 的杂合子只显示出可数的带数(10-20条)。这些引物使AluPCR技术扩展到几个不同的 领域，包括用杂合子中扩增的产物作杂交探针鉴别从总人DNA库特异基因组区域中克 隆的DNA，及对从脉冲中电场凝胶中分离出的DNA片段进行扩增。加入的寡聚核苷酸的 性质对确定这些反应中的参数是关键的。我们希望能设计出可从一个Alu重复子的两 个方向进行扩增的引物，从而使循环进行PCR前需酶切模板，并再连接环化)，避免要 求在相邻区域要有两个Alu重复子才能扩增的条件。

从克隆的基因组DNA进行AluPCR

　　当与紧邻克隆位点的载体序列末端引物结合起来时，AluPCR引物可直接克隆DNA中人 的插入序列。这对于从YAC克隆中分离插入片段特别有用，而别的方法则繁琐和费时 用这个方法，我们从约75%的含人插入片段的YAC克隆中分离出片段，并用这些片段作 探针测定YAC插入片段在体细胞杂合子图谱中的染色体定位。这个方法用于Lambda噬 菌休载体中的克隆时，可不需培养噬菌体来提取DNA不能从插入片段得到探针，所有 的Lambda克隆在这些反应中都已产生产物，所有的产物用染色体图谱定位探针时都得 出预期结果。这可为克隆的DNA定位节约大量时间。重要的是，与在体细胞杂合子中 扩增相反，克已克隆的人DNA片段上进行扩增所用的引物不必是人特异的，大部分测 试Alu引物都产生产物。

　　AluPCR产物的带形对分析体细胞杂合子和已克隆的序列中人类DNA区域也是有用的， AluPCR片段(APF)可?#147;指R怯形”法用来测定杂合子或克隆间的重叠区域