囊胚来源ES细胞系的分离和培养

小鼠胚胎干细胞（ES细胞）不仅可以作为研究哺乳动物发育调控机制的模型，同时也可以作为基因研究的载体。

器材：

试剂：

ES细胞系的分离和培养的基本过程可分为如下几步：

1．配制试剂

（1）MEF培养液：450 ml DMEM＋50 ml FBS＋5 ml 100xpenicillin and streptomycin，4 ℃保存，3～4周有效。

（2）建系培养液：400 ml DMEM／F12＋100 ml KOSR＋5 ml 200 mmol／L（100x）glutamine＋5-ml（100x） b-mercaptoethanol＋50 μl LIF，过滤除菌，4 ℃保存，3～4周有效。

（3）胚胎干细胞培养液：knockout DMEM＋20％ Knockout SR＋penicillin（100 U／ml）／streptomycin（100 μg／ml）＋2 mmol／L L-glutamine＋1xminimal essential medium nonessential amino acids＋100 μmol／L β-mercaptoethanol（100x浓 储液，10 ml PBS中加入7μl β-mercaptoethanol）＋1000 U／ml recombinant mouse leukemia inhibitory factor。

（4）细胞冷冻液：50 ml FBS（50％）＋40 ml DMEM（40％）＋10 ml DMSO（10％）。需当天新鲜配制。

2．饲养层的准备

（1）原代细胞的培养：

①脱臼法处死E13.5孕鼠，用70％ 乙醇消毒其腹部表面，于腹中线位置横向撕开皮肤，向两侧翻开，显露腹壁。

②用无菌剪刀沿腹中线纵行剖开显露腹腔脏器，将子宫从母体中取出，置于盛有10 ml DPBS的10 cm培养皿上，放回超净台并反复洗涤3～4次，移入新的DPBS。

③在新的DPBS中将剪开子宫撕破胎膜取出胎鼠，再用PBS洗涤2次。

④去除胎儿头部、内脏、四肢，并用眼科剪将胎鼠躯干剪成1 mm3以下的碎块，加入2 ml 0.05％ trypsin-EDTA并收集到15 ml离心管中，在37 ℃孵育20分钟，同时轻微地摇晃促使细胞消化；⑤加入5 ml的DMEM＋10％ FBS终止消化。

⑥收集消化液，1200 r／min离心5分钟，弃上清，并用新鲜预热的DMEM＋10％ FBS重悬细胞。

⑦细胞悬液以2x10铺板于100 mm培养皿中，加入10 ml新鲜DMEM＋10％ FBS培养基，继续培养夜。

⑧第2天早晨换液，弃去未贴壁的细胞，继续培养。

⑨当原代细胞汇合成片，占培养皿80％～90％时进行传代培养。

（2）小鼠成纤维细胞传代培养：

①当成纤维细胞生长至80％～90％汇合后，弃去培养基，加入DPBS冲洗一遍，弃掉。

②加入0.05％ trypsin-EDTA，放入培养箱中约3分钟，消化细胞。

③待细胞间隙加大，胞体趋于变圆时加入DMEM＋10％ FBS培养基中止消化，反复吹打成单细胞悬液，1200 r／min离心5分钟。

④弃上清，加入少许培养基重悬沉淀，按1：3比例重新接种于新的培养皿中。

（3）饲养层细胞的制作：

①用P1或P2代的小鼠成纤维细胞制作饲养层，P3～P5代的细胞活力明显降低，不能够支持ES建系的过程，故不利于做饲养层。

②将生长至90％～95％汇合的小鼠成纤维细胞培养液弃去，加入含有10 μg／ml mitomycin C（终浓度10 μg／ml，no．107409；Roche，Basel，Switzerland）的DMEM＋10％ FBS培养基，以阻止其有丝分裂。

③mitomycinC处理2.5小时后，弃去含有mitomycin C的培养液，用DPBS洗两次，加入0.05％ trypsin-EDTA，放入培养箱中消化约3分钟。

④待细胞消化至胞体趋于变圆时，加入DMEM＋10％ FBS培养基中止消化，反复吹打成单细胞悬液，1200 r／min离心5分钟。

⑤弃上清，加入少许培养基重悬沉淀，冻存或铺于以1x10密度接种于gelatin包被的35 mm培养皿中备用。

注意：＊mitomycin C见光容易降解，存放于暗处。Mitomycin C为剧毒物质，使用时请做好防护。

（4）培养板的包被：

①制作gelatin溶液：称取适量gelatin（no．G1890，Sigma）溶于Milli-Q水中制备成0.1％ gelatin溶液，高温高压灭菌，室温储存备用。

②将需要包被的培养皿用适量gelatin溶液铺至皿底完全覆盖，放入37 ℃培养箱中1小时。

③使用前将皿中剩余的gelatin弃掉，放在超净台中风干至少30分钟。

④用细胞培养基或PBS清洗一遍后再用。

3．胚胎干细胞建系

（1）饲养层的准备及囊胚接种前准备：

①在接种囊胚的前一天，按照上述方法准备饲养层，一般在12孔板或4孔板中接种。

②在接种前的1～3小时，更换饲养层的培养液为胚胎干细胞培养液。

（2）囊胚的获取及接种：E3.5的妊娠小鼠用于胚胎干细胞建系囊胚的获得。

①脱臼法处死E3.5孕鼠，用70％ 乙醇消毒其腹部表面，于腹中线位置横向撕开皮肤，向两侧翻开，显露腹壁。

②用无菌剪刀沿腹中线纵行剖开显露腹腔脏器，将子宫从母体中取出，立即放入盛有Knockout DMEM（no．10829-18，Gibco）＋1μlHEPES（15630，Gibeo）（HEPES／DMEM）的35 mmI皿L中，将多余的脂肪剔除。

③将剔除脂肪的子宫放入35 mm皿中，加入2 ml预热的HEPES／DMEM，用带有已去尖的0.6 mm针头的装有HEPES／DMEM的2 ml注射器冲子宫。

④在体视显微镜下观察并收集囊胚。

⑤用玻璃吸管将囊胚移入已经更换了胚胎干细胞培养液的饲养层上，放回培养箱，静止等待6天后观察。

4．胚胎干细胞系传代培养及冻存

（1）第一次传代培养：

①提前一天根据需要传代的克隆数在24孔板中准备适量的饲养层细胞。

②传代前2小时，将饲养层的培养液换成ES培养液。

③根据克隆数在96孔板中加入25 μl的0.25％ trypsin，待用。

④弃去需要传代的细胞的培养液，用DPBS洗一遍，再向皿中加入2 ml PBS。

⑤用10 μl移液器从培养皿中挑取ES样克隆，放入有0.25％ trypsin的96孔板中。

⑥37 ℃培养箱中消化5分钟后，加入200 μl的ES培养液终止消化。

⑦反复吹吸使之消化成单个细胞，并移入铺有饲养层的24孔板中，加入1 mlES培养液。请确保每个24孔板的孔中只有一个克隆。

（3）常规传代培养：

①提前一天根据需要传代的细胞量在培养皿／板中准备适量的饲养层细胞。

②传代前2小时，将饲养层的培养液换成ES培养液。

③需要传代或冻存的ES用PBS冲洗两次。

④加入 trypsin37 ℃消化3～5分钟，直至细胞卷起。

⑤加入ES培养液反复吹吸至成为单个细胞。

⑥1200 r／min离心5分钟，去上清，用ES培养液悬浮。

⑦将悬浮好的细胞悬液加入准备好的饲养层之上，置于5％ 的CO₂培养箱中37 ℃培养。

⑧通常以1：2或1：3比例传代，传代后每天换一次新鲜的培养液。通常ES细胞3～5天传代一次。

（4）ES冻存：

①需要冻存的ES用PBS冲洗两次。

②加入trypsin，37 ℃消化3～5分钟，直至细胞卷起，

③加入ES培养液反复吹吸至成为单个细胞。

④1200 r／min离心5分钟，去上清，用细胞冻存液悬浮，装入冻存管。

⑤将冻存管放入冻存盒中置于-80 ℃冰箱，使其以-1 ℃／min的速度缓慢降温。

⑥细胞可于-80 ℃冰箱内暂存，或放入液氮罐中长期保存。

（5）ES复苏：

①将需要复苏的细胞从液氮罐中迅速放入37 ℃水浴锅中摇晃，直至冰晶消失一半。

②向冻存管内缓慢加入0.5 ml MEF培养液，并将细胞悬液加入含有5 ml MEF培养液的15 ml离心管中。

③1200 r／min离心5分钟，弃上清。