【鸡毛蒜皮】之巧用PCR—重组质粒的快速高通量筛选

【鸡毛蒜皮】之巧用PCR—重组质粒的快速高通量筛选
近几年，随着国内更多的公司掌握了Taq酶的制备技术，市场竞争进入白热化，Taq酶的价格一路猛跌，有的公司甚至推出跳楼价—1毛钱一单位。且不说具体哪个公司的质量好，单单从价格上就已经让人感觉到了类似北京冬天的大白菜和夏天的西红柿的味道。从另外一个方面来看，限制型内切酶的价格却多年不变，我们曾经一度以价格优势占领大片国内市场并把内切酶普及到更多实验室的华美公司近几年渐渐从人们的视线中淡出，而近两年崛起的大连Takara的东西质量不错，在价格上接近了华美，但是毕竟没有出现大幅降价的景象。相比之下，利用PCR筛选重组子的方法的成本已经低于传统的提质粒——酶切法。
方法：1）质粒的连接——转化一切如《分子克隆》所描述；2）平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时），我们的工作开始了；3）准备并分装好PCR反应液（除了模板之外的其它PCR反应液的组分），引物最好使用质粒载体上多克隆位点两侧的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；4）用灭菌的牙签（最好是半根，这样节约，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号；5）PCR扩增，agarose电泳；6）对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到含有相应种类和浓度抗生素的5毫升LB培养基中，37度培养，8－12小时后提质粒，酶切鉴定确认。
该方法的注意事项：1）使用前提之一：需要挑取的克隆较多（也就是克隆效率低），传统提质粒后酶切法费时费力，加一步2小时的PCR初筛可以使工作量大为降低；
2）使用前提之二：某些克隆的鉴定用限制性内切酶无法和不方便进行，可以用PCR筛选代替；
3）注意：除非万不得已，两条引物至少有一条是与载体序列结合的引物，否则出现假阳性不要来找我！