重组质粒的筛选

重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选或α互补筛选的方法。

一、抗生素平板筛选

【实验原理】

目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp 的抗性基因，因此在含有Amp 和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落。

【操作步骤】

1．制备含有Amp 和 Kan 的LB琼脂培养板

2．将100μl 转化菌液用无菌涂布器均匀涂布于含有Amp 和Kan培养板上，37℃培养12-16h 。

3．在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒。并将其接种于含Kan的LB液体培养基2ml中培养8-16h。

4．小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。

二、α互补筛选

【实验原理】

适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如 pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。

由α互补而产生的 Lac 细菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。

【试剂】

1．X-gal（20mg/m l）：将20mg X-gal溶于l ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

2．IPTG（200mg/ml）：将1g IPTG溶于4 ml去离子双蒸水中，定容至5 ml，用0.22μm过滤器除菌，-20℃保存备用。

【操作步骤】

1．制备含相应抗生素的琼脂平板。

2．于平板表面加 X-gal 40μl 和IPTG 4μl，并用无菌玻璃涂布器将试剂均匀涂布于整个平板表面。37℃静置l h。

3．将100μl 转化的菌液涂布于平板表面，置37℃培养箱20 min后，倒置平板继续培养12～16h。

4．中止培养后，将平板静置4℃ 4h，使蓝色充分显现，平皿上显示蓝色和白色两种菌落。

5．挑取白色菌落置2 ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃摇床培养8～12h。

6．提取质粒，以限制性酶切分析进一步鉴定。