重组质粒的筛选与鉴定

可以在 蛋白质 水平和目的基因功能水平等各个层次鉴定重组子.基因水平的鉴定有酶切鉴定、 PCR 鉴定、核酸杂交和基因序列分析等.蛋白质水平鉴定有插入失活双 抗生素 对照筛选(例如 Tet r 和 Amp r )和插入失活 LacZ' 基因的蓝白斑筛选等.

表达载体可进行插入方向鉴定和表达产物的免疫学和生物学活性鉴定.一般重组质粒鉴定主要按照表型筛选、酶切鉴定和测序鉴定的顺序进 行.

(一)插入片段长度鉴定

1、酶切鉴定

由表型鉴定从平皿中挑取单克隆,在液体培养基中扩增,制备质粒. 质粒 可能以线性、开环和闭环超螺旋等 3 种形式存在.尽管这 3 种形式的质粒分子量一样,但是它们的电泳速度不一样,电泳时可能会出现 2-3 条带.

用设计的内切酶进行酶切后电泳,如果载体中有插入的目的基因,电泳出现两条带,一条是载体,另一条是目的基因；反之,电泳后就只有一条载体带.

在一 块胶上同时设分子量标记、空质粒等对照,就可以看出载体中是否有插入片段以及插入片段的大小.酶切鉴定是克隆鉴定的第一步.如果酶切电泳条带与设计相符, 可以初步确定目的基因插入了载体 ,下一步就是进行测序鉴定.

2、PCR鉴定

现在很多载体克隆位点两侧存在恒定的序列,例如 T 7 和 SP 6 启动子 ,针对这种序列的 PCR 引物 可以很方便地从专业公司购买或者合成.有时插入基因本身就是 PCR 产物,实验室已有这些引物.

对所挑选的菌落中的质粒进行 PCR 扩增以鉴定是否有插入片段以及插入片段的大小.例如 T-A 克隆载体,克隆位点两侧有 T 7 、 SP 6 和 M 13 启动子通用序列,用 PCR 鉴定就非常方便.但是多数实验室更喜欢用酶切鉴定.

(二)插入片段方向性鉴定

如果需要 基因表达 ,必需鉴定外源基因在重组质粒中的连接方向.这对于在克隆时使用单酶切位点的情况尤为重要.

可以利用联合酶切方案进行目的基因的插入方向鉴 定.在基因插入的邻近末端部位选择一个单酶切点( B ),在载体上选一个单酶切点( A ),用这两个内切酶分别酶切两份重组质粒,正、反两个方向的插入将产生不同大小的 DNA 片段,通过凝胶电泳即可鉴定插入片段方向是否正确.

(三)DNA序列测定

用酶切初步鉴定正确的重组质粒需要进一步作测序鉴定,测序完全正确的重组质粒才可以进行下一步实验.尽管很多单位都有 DNA 测序仪,但是一般的基因工程实验室并不自己测序.因为国内很多专业 生物工程 公司提供测序服务,方便快捷,收费合理.它们一个反应可以测定 500-700bp ,其中前 500 bp 可以保证极高的正确性.

DNA序列测定技术是建立在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上,可以区分1个碱基的差异.

对于一个待测序列的 DNA 片段,先将其转变成一系列的放射性核素标记的单链寡聚核苷酸,以使其一端为一固定的末端,而另一端由于长度不一,成为一系列相差 1 个碱基的连续末端.在建立的4种反应体系中,寡聚核苷酸分别终止于不同的位置的A、T、G或C碱基.

4种反应体系的寡聚核苷酸产物,在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样于相邻的加样孔进行电泳分离.由于全部可能产生的不同大小的寡聚核苷酸都存在于 4 种反应产物中,故从放射自显影后的 4 种末端寡聚核苷酸梯子形图谱中就可以直接读出 DNA 的顺序.由于技术的发展,现在多数情况下使用荧光标记 ,这样不仅安全环保,而且速度更快.