【资源】一种被广泛用于实时定量 PCR 的绿色荧光 DNA 染料

丁香园2015-06-29

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<center> EvaGreen qPCR 荧光染料</center>

一种被广泛用于实时定量 PCR 的绿色荧光 DNA 染料

 

EvaGreen®是一种用于实时定量 PCR（qPCR）的 DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于 SYBR Green I。除了有相似的光谱特性，EvaGreen 有三个主要特点使它区别于 SYBR Green I。

首先，EvaGreen 对 PCR 的抑制性远小于 SYBR Green I。因此，使用EvaGreen 进行的 qPCR 实验可以使用快速 PCR 步骤。同时，EvaGreen 在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于 SYBRGreen I 扩增信号（图 1 ）。较高浓度的 EvaGreen 也消除了“染料重分布”的缺陷，使 EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（ HRM ）（图 2）。该分析正被越来越多的用于 PCR 后的基因分型和异源双链分析。由于 SYBR Green I对 PCR 的抑制性，从而要求其使用浓度必须很低，因此 SYBR GreenI 无法解决由低浓度造成的染料重分布问题，既不能用于多重 PCR 也不能用于 HRM 。同时，染料重分布问题也可能影响常规熔解曲线的可靠性，因为低熔点的 DNA 链可能由于这种原因而无法检测到。

另外，EvaGreen的稳定性极强。在正常的储存、操作和 PCR 过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里，也可以反复冻融。与之相反，SYBR Green I不稳定而且降解后对 PCR 抑制性更强。EvaGreen 降低了细胞膜透性，因而比 SYBR Green I更加安全。独立实验室的测试结果显示，EvaGreen 既没有诱变性也没有细胞毒性。相反，虽然 SYBR Green I本身诱变性很弱，但它在细胞中可能抑制了正常 DNA 的修复机制，使其有诱变增强作用。考虑到 PCR 的广泛使用，其安全性应该足够重视。要获取 EvaGreen 安全性测试报告，请到 <a href="http://www.biotium.com或" target="_blank">www.biotium.com或</a> <a href="http://www.bio-ope.com" target="_blank">www.bio-ope.com</a> 网站下载。

图 1．分别使用 EvaGreen®（红色）、SYBR GreenER TM(绿色，Invitrogen)和 Power SYBRTM（黄色，ABI ）扩增 Myc 基因片段（75ng huDNA ，ABI）。所有反应均以复管形式使用相同的循环条件（95 ℃ 15 秒，60 ℃ 60 秒）在 ABI 7900 上完成。

<center> 高分辨率溶解曲线分析（HRM)</center>

图 2 . 在 Rotor Gene 6000 上使用 EvaGreen 进行高分辨率熔解曲线（ HRM ）分析可以明显的区分三个不同的基因型：突变型（红色）、杂合型（紫色）和野生型（蓝色）。（数据由 Corbett Research 提供）

特性:

极高的灵敏度

在推荐浓度下使用时可以获得最强的 PCR 扩增信号

PCR 抑制性极小

智能化的“按要求释放”DNA 结合技术

使得 EvaGreen 对 PCR 的抑制远小于 SYBRTM Green I

和快速 PCR 兼容

对 PCR 干扰极小，从而极大的缩短了 PCR 延伸时间

非常适合 HRM 分析

无“染料重分布”缺陷

兼容 PCR 后的高分辨率熔解曲线（ HRM ) 分析

兼容多重 PCR

在推荐浓度下使用时，无扩增子之间的染料迁移现象

超强稳定性

在大部分生化条件下非常稳定，可在室温下储存并可反复冻融

优越的兼容性

和 SYBRTM GREEN I光谱相似,和各知名品牌的 qPCR 仪器兼容。

用 EvaGreen TM 替代 SYBR Green 1 ，毋须改变任何您目前使

用的操作步骤和仪器设备

<center> Fast-Plus EvaGreenqPCR试剂盒</center>

一种既适用于快速循环 qPCR 又适用于高分辨率熔解曲线（ HRM ）分析的 PCR 试剂盒。

技术特点

Fast-Plus EvaGreen® qPCR Master Mix 是一种既适用于快速循环 qPCR 又适用于高分辨率熔解曲线（HRM）分析的 PCR 试剂。该试剂体系囊括了PCR领域的两项突破性技术：EvaGreen® PCR 染料和 Cheetah Taq hotstart DNA 聚合酶。因此，与其他商业化的master mix 产品相比，Fast-Plus EvaGreen® qPCR Master Mix 可以为客户带来更为精确的实验结果。

? EvaGreen®Dye:

EvaGreen®是Biotium公司的DNA结合染料，它是一种同时适用于实时 PCR 和高分辨率熔解曲线（HRM）分析的新一代染料。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制，选择性的结合双链DNA。这一机制保证了较低的 PCR 抑制作用，同时也允许在染料饱和浓度以下进行高分辨率熔解曲线（HRM）分析。由于EvaGreen®染料在光谱特性上类似于 FAM 以及 SYBR Green I ，因此这种染料兼容所有商业化的 qPCR 仪器。此外，和 SYBR GreenI 以及 SYBR GreenER 不同的是， EvaGreen®染料非常稳定且无致突变性和细胞毒性。

? Cheetah Taq:

Cheetah Taq 是Biotium公司的一种新型化学修饰的热启动 DNA 聚合酶。和 AmpliTaq Gold 不同的是， Cheetah Taq 在标准热启动条件下（例如：使用 pH 8-9 Tris 缓冲液并置于94°C），仅需 2分钟即可完全激活。而另一方面，与 Platinum Taq 等基于抗体技术的热启动聚合酶相比，Cheetah Taq 在室温下完全没有活性，同时也降低了内在的 DNA 污染。此外，总体来说，Cheetah Taq

在 -20°C 和 4°C 时的稳定性都优于 AmpliTaq Gold，这也保证了产品在低温保存时仍能维持自身的高品质。

由拥有以上两项技术专利的B i o t i u m 公司生产的F a s tEvaGreen® Master Mix 产品已经使用各种类型的扩增模版进行过测试，包括：短片断（<100bp），长片断（>700bp），富含AT的片断，富含 GC 的片断以及基因组起始区。实验结果显示，Fast-Plus EvaGreen Master Mix 扩增效率优异，结果远优于其它供应

商的基于 SYBR 的 master mix 产品。由于产品中的染料技术和酶技术都来源于Biotium公司，致使Biotium提供的master mix 产品在价格上是最具竞争力的产品之一。Biotium公司的 master mix产品以高品质和富有竞争力的价格，为客户提供了其他同类产品难以的价值。

使用效果:

Fast-Plus EvaGreen® Master Mix 产品已经使用各种类型的扩增模版进行过测试，包括：短片断（<100 bp），长片断（>700bp），富含 AT 的片断，富含 GC 的片断以及基因组起始区。实验结果显示， Fast-Plus EvaGreen® Master Mix 扩增效率优异，结果优于其它供应商的基于 SYBR 的 master mix 产品。图 1 和图 2 分别比较了 Biotium 公司的 Fast-Plus EvaGreen® Master Mix 产品和市场上其他两家主流公司（ A公司和 Q公司）生产的基于 SYBR 的快速 qPCR master mix 产品在扩增人类基因组 DNA 和人类大脑 cDNA方面的效果。结果显示，Fast-Plus EvaGreen® Master Mix 的灵敏度远远高于其他两款产品，检测线性范围也更宽。特别是在扩增较为困难的人类基因组 DNA 方面，Fast-Plus EvaGreen® Master Mix的优势显示的更为明显（图 1）。使用 EvaGreen Master Mix 获得的 Ct 值较小，线性检测范围达到了 5 个数量级，而使用 A 公司和 Q 公司的产品，特别是 A 公司的产品，Ct 值延后现象比较严重，线性范围变窄（对应的是图上两条曲线之间的距离不规则）。图 3 和图 4 显示，三种产品在融解曲线分析上的结果和上述 qPCR的结果是一致的。使用 Fast-Plus EvaGreen Master Mix 产品生成的融解曲线信号远远强于其他两种基于 SYBR 的快速qPCR mastermix 产品。

通用性：

除了在 qPCR 方面的应用， Fast-Plus EvaGreen® Master Mix也能被用于高分辨率融解曲线分析（HRM）以及基于核苷酸探针的qPCR 应用。 HRM 是一种最新发展出来的 DNA 分析技术，可用于检测点突变。由于 HRM 分析简单且成本低，这种方法的应用越来越广泛。要进行精确的 HRM 分析，首要的条件就是染料的浓度应该高于或远远高于 qPCR 所需最优的 SYBR Green I 或其他同类型 DNA结合染料的浓度。因此，这些染料都无法用于制备同时适合 qPCR和 HRM 的 master mix 产品。尽管目前市场上有一些声称同时适合qPCR 和 HRM 的 master mix 产品使用了 SYBR 或其他类似染料，但由于需要在染料浓度上兼顾两种应用，它们的效果都不尽如人意。由于 EvaGreen 使用了创新设计的 “ 按要求释放 ”DNA 结合机制，它对 PCR 的抑制作用很低，在 qPCR 实验中可以使用较高的浓度以达到最大的荧光信号值。同时，这时候的染料浓度也能达到HRM 分析所需的理想浓度，从而实现了一种 master mix 产品同时完美的适用于 qPCR 和 HRM 两种应用。此外， Fast-Plus EvaGreen® Master Mix 的另一项独创应用是在同一 qPCR 反应中同时使用 EvaGreen®和一种或多种核苷酸探针（例如： TaqMan 剖探针或者 AlleLogic Biosciences 公司的AllGlo 探针）。在这项应用中， EvaGreen®染料使用绿色通道检测总的 DNA 生成，而核苷酸探针可以在红色通道同时检测每个目标片断的扩增情况。更重要的是， PCR 之后还可以进行融解曲线分析，以确定有几种片断被成功扩增。

图1: 比较Biotium 公司 Fast EvaGreen Master Mix 产品和市场上其他 SYBR Green mastermix 产品在扩增人类基因组 DNA 的 ATPG 片断（ 104个核苷酸的片断，编码 ATP 基因）方面的效果。

图 2. 比较 Biotium 公司 Fast-Plus EvaGreen Master Mix 产品和市场上其他两家主流公司（ Abi 公司和 Qiagen 公司）生产的 SYBR Green master mix 产品在扩增人类大脑 cDNA的 B2M 片断（ 71 个核苷酸的片断，编码 B2M 转录子）方面的效果。实验在同一块 PCR板上进行，使用 ABI 7900 Fast 实时 PCR 仪， cDNA 的上样量为分别为 400 pg，40 pg，4 pg，0.4 pg，0.04 pg 和 0 pg 。以不结合 DNA 的 ROX 染料作为参照计算最终的 ΔRn 值，从而真实地反映每种产品的荧光值变化。由于 Q 公司的 master mix 激活相对较慢，整块 PCR 板的激活条件都是 95 oC 下 5 分钟。 PCR 循环为三步： 96°C 下 5s ，之后 60°C 下 5 s ，接着 72°C 下 25 s 。左上方的小图显示的是放大以后基线附近的扩增情况，由于两种基于 SYBR 的快速 master mix 产品扩增信号远远弱于 EvaGreenMaster Mix ，放大以后能更好的观察扩增曲线。

图 3. 比较 Fast-Plus EvaGreen Master Mix 产品和来自 A 公司以及 Q 公司的产品在融解曲线分析方面的表现。分别使用三种产品对 200 ng 人类基因组 DNA扩增后的样品测定融解曲线。扩增的详细信息参见图 1 中的描述。

图 4. 比较 Fast-plus EvaGreen Master Mix 产品和来自 A 公司以及 Q 公司的产品在融解曲线分析方面的表现。分别使用三种产品对 400 pg 人类大脑 cDNA 扩增的样品测定融解曲线。扩增的详细信息参见图 2 中的描述。

图 5. 对图 4 中的产物进行高分辨率融解曲线分析（ HRM ）。用归一化的荧光值对温度作图（上图），以及用荧光值的导数对温度作图（下图）。两张图上对于同一基因型都仅绘出了一条具有代表性的曲线。 HRM 成功地分析出了所有的三种基因型。