内皮细胞培养步骤

1. .培养人脐静脉内皮细胞：
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 新生儿脐带 由重庆医科大学附属第一医院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带。长度>20 cm，两端扎紧投入到4℃脐带保存液中，1 h内送细胞培养室。
1．1．2 仪器与试剂倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；超净工作台(苏州净化仪器厂)；5％C02培养箱(美国Heraeus公司)；离心机(上海安亭仪器厂)；25cm2培养瓶、六孔培养板(美国CA)star公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS)、M199培养基、I型胶原酶(美国Sigrna公司)；明胶、胰酶(美国A1Tlresco公司)；灭菌生理盐水(锦州医学院附属第一医院制剂室)；鼠抗人Ⅷ因子单克隆抗体、辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1．2 方法
1．2．1 试剂配制 ：(1)脐带保存液：生理盐水、葡萄糖100 mmoL／L、100 U／ml青霉素一100 U／m1链霉素。(2)磷酸盐缓冲液(PBs)。(3)D―Hanks液。(4)0．1％ I型胶原酶：用PBS配制。(5)0．05％胰酶一0．02％ 乙二胺四乙酸二钠盐(ED―TA)溶液：用D―Hanks液配制。 内皮细胞培养液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1青霉素一100 U／m1链霉素的M199培养基。(7)0．2％ 明胶：用PBS配制。以上试剂均过滤除菌。
1．2．2 人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养： 参照Jaffe 和Lin S等方法并加以改进。在无菌条件下取新生胎儿脐带，长度>20 cm。剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分，尽量挤干净脐带内血液。用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。用输血器内接有穿刺器的软管，找到脐静脉，将软管针头一端插入脐静脉，用止水夹固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止；将脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉中灌入0．1％ I型胶原酶溶液，使之充盈，夹闭软管，37℃水浴中孵育20 min，其间轻轻挤压并旋转脐带，以使酶溶液充分接触血管内壁，然后将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。用2倍于消化液的温PBS冲洗脐静脉，一并收集于小三角瓶中，将细胞悬液装入10 ml离心管，1 000 r／min离心10 min，弃上清，吹打悬浮，再次离心10 min，重悬细胞并接种于铺有明胶的25 cm2培养瓶中，置于37℃ 5％ C02饱和湿度培养箱中培养，24 h后更换培养液，以后每隔2 d换液1次。
1．2．3 人脐静脉内皮细胞的传代培养 当原代细胞融合80％以上后，加入0．05％ 胰蛋白酶一0．02％EDTA 溶液消化，倒置显微镜下观察，当细胞皱缩变圆、彼此分离时弃消化液，加入细胞培养液终止消化，收集细胞悬液。1 000 r／min离心10 min，弃上清，制成单细胞悬液。此时可用0．5％台盼蓝染色，计算活细胞百分率，并以血细胞计数板计数。调整细胞浓度为1×10 个／ml，接种于培养瓶或培养板中继续培养。待细胞长满，彼此融合成片时依上述方法继续传代培养。