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内皮细胞屏障的通透性检测

相关实验:内皮细胞的通透性检测

别名:细胞渗漏,伊文思蓝渗透,HUVEC

最新修订时间:

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合作专家 | 张望博士

感染病学 浙江大学

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审核专家 | 姬杨丽敏博士

高分子化学与物理 中国科学院化学研究所

简介

内皮屏障功能的变化可调控血管向组织的渗漏,以维持稳态。内皮细胞通透性改变在多种疾病的病理生理过程中具有重要的意义,目前已建立了一系列体内外内皮细胞屏障通透性的检测方法。

原理

伊文思蓝是一种常用的偶氮染料,与血浆白蛋白有很高的亲和力,可用来标记白蛋白。在生理条件下,内皮不能渗透白蛋白;而在病理条件下,内皮细胞间连接蛋白功能障碍导致屏障通透性增加,此时,可在单层内皮细胞模型中检测到伊文思蓝-白蛋白的渗漏。

用途

在体内及体外模型中评估内皮屏障的通透性。

材料与仪器

Transwell 细胞小室,细胞培养板,细胞培养基,跨膜细胞电阻仪,伊文思蓝(EB),牛血清白蛋白(BSA)。

步骤

1. 单层细胞屏障建立: 细胞消化、计数并调整细胞浓度至 1×105 细胞/mL,移液器取 1 mL 细胞悬液接种于孔径为 3 μm 的 Transwell 小室中,并将小室插入 24 孔细胞培养板,培养板下室提前加入 1 mL 完全细胞培养基,置于 37 ℃,5% CO2 细胞培养箱中,每两天使用细胞电阻仪测量一次跨膜电阻(TEER)并记录数值,至 TEER 稳定且持续时,认为单层细胞屏障形成;

2. 伊文思蓝-血清白蛋白(EB-BSA)工作液配制:2% EB 贮存液与 60 倍体积的 4% BSA 混合,用 PBS 稀释至终浓度为 0.67 mg/mL;

3. 伊文思蓝渗漏测定:取出 Transwell 小室,PBS 洗 2 次后,放入新的 24 孔板,下室加入 600 μL 4% BSA 溶液,上室加入 100 μL EB-BSA 工作液,以保证上室与下室液面高度一致,消除液面高度差引起的液体渗漏,于 37 ℃,5% CO2 细胞培养箱中平衡 1 h;

4. 渗透性评估:① 取出 Transwell 小室,吸取下室液体于 1.5 mL EP 管中,1 000 rpm 离心 5 min,取 200 μL 加入 96 孔板;② 另将 EB-BSA 工作液(初始浓度为 0.67 mg/mL)倍比稀释,分别取 200 μL 加入 96 孔板,使用多功能酶标仪在 620 nm 波长下测量 OD 值并制作标准曲线;③ 根据标准曲线计算 Transwell 下室液体中 EB 浓度,该浓度代表由上室渗漏至下室的伊文思蓝的含量,即单层内皮细胞的通透性。

注意事项

1. 根据实验需要可选择不同孔径的 Transwell 小室,常用 0.4 μm~3 μm 孔径;

2. 造模前需确认屏障的完整性,可通过跨膜电阻(TEER)检测评估完整内皮屏障的形成;

3. 检测 EB-BSA 渗漏时,需保证 Transwell 上室及下室液面一致,避免因液体高度差所引起的渗漏。

常见问题

1. 推荐接种的细胞密度是多少?

不同的实验使用细胞种类不同,培养时间和方法亦有区别,建议参考文献。

2. 是否需要对小室膜进行包被,如胶原蛋白包被?

一般来说,若细胞在 TC 处理表面的培养器皿中进行培养时贴壁状态良好,则不需要对小室膜进行额外的包被处理。只有在细胞贴壁状态不好,并且在之前的培养中都需要进行包被,才需要对小室膜进行包被,但请注意包被层可能会影响到后续物质交换,建议参考相关文献。

3. 内皮细胞在 Transwell 小室中生长不均匀。

为优化细胞在 Transwell 小室上的生长,应避免培养瓶接种培养细胞后,底部细胞覆盖率超过 85%~90%;完成细胞接种后,务必小心地将 Transwell 板转移至培养箱中。避免将含有悬浮细胞的培养基从 Transwell 小室泄漏至培养板中。

4. TEER 值不稳定。

在进行单层内皮细胞模型的 TEER 测定之前,将小室平衡至室温,可以获得更为统一的测定结果,不同内皮细胞平台期 TEER 值也不尽相同;请注意上室与下室中液体的体积会影响测定数值,请严格统一每次测量时的工作体积。

来源:丁香实验

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