细胞培养过程中的注意事项及试剂配制

四. 细胞培养用液的配制与消毒

器材与试剂：

干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH 计、磁力搅拌器。

具体步骤：

(1) 水的制备：

细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.

(2)PBS 的制备与消毒( 也可用于其它BSS ，如：Hanks ，D-Hanks 液的配制) ：

1. 溶解定容：将药品（NaCl 8.0g ，KCl 0.2g ，Na₂ HPO_4・ H₂ O 1.56g ，KH₂ PO₄ 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml ，摇匀即成新配制的PBS 溶液。

2. 移入溶液瓶内待消毒：将PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8 磅消毒20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

(3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH 为8.0 、温度为37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+ 、Mg2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+ 、Mg2+ 的BSS ，如：D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1. 称取胰蛋白酶： 按胰蛋白酶液浓度为0.25 ％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH 到7.2 左右）或PBS （D-hanks ）液中。搅拌混匀，置于4℃ 内过夜。

2. 用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃ 保存以备使用。

(4) 青、链霉素溶液的配制于消毒

1. 所用纯净水（双蒸水）需要15 磅高压20 分钟灭菌。

2. 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80 万单位/ 瓶，用注射器加4ml 灭菌双蒸水。链霉素是100 万单位/ 瓶，加5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为20 万单位。

3. 使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100 单位/ml 。1 单位＝1 微克？

(5).RPMI1640 的制备与消毒：

1. 溶解、调PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3 的双蒸水中, 并用双蒸水冲洗包装袋2-3 次( 冲洗液一并加入培养基中), 充分搅拌至粉剂全部溶解, 并按照包装说明添加一定的药品. 然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100 单位/ml 。然后用一个当量的盐酸和NaOH 调PH 到7.2 左右。最后定容至1000ml ，摇匀。

2. 安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

3. 抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

4. 分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃ 冰箱内待用。

5. 使用前要向100ml 培养液中加入1ml 谷氨酰胺溶液（4℃ 时两周有效）。

(6) 血清的灭活：

细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃ 水浴中灭火30 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

(7)HEPES 溶液：

HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH 范围。使用终浓度为10-50mmol/L ，一般培养液内含20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。

1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下：

准确称取HEPTS 238.3g ，加入新鲜三蒸水定容至1L 。过滤除菌，分装后4℃ 保存。

注意：因为现在市售HEPES 为约10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES 的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766 克HEPES 溶于20ml 三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml ）加入1L 培养液中，或者每100ml 培养液中加入2ml 即可。

(8) 谷氨酰胺：

合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃ 下放置1 周可分解50 ％，故应单独配制，置于-20℃ 冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃ 冰箱中储存2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。

一般培养液中谷氨酰胺的含量为1 ～4mmol/L 。可以配制200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g 溶于三蒸水加至100ml 即配成200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃ 保存，使用时可向100ml 培养液中加入1ml 谷氨酰胺溶液。

(9) 肝素溶液的配制：

含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml 。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56 克/ 瓶，配制时，可将其溶于100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为­­ ℃ 。使用时，向100ml 培养液中加入1ml （精确可加入0.9ml ）即可。

(10) Ⅰ 型胶原酶：

0.1 ％Ⅰ 型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ 型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml 小瓶-20℃ 保存。

(11). 明胶溶液：

因为明胶难于过滤，所以配制0.1 ％明胶溶液必须用无菌的PBS 配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1 克（配成100ml 溶液）― 即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01. 的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml 小瓶中，4℃ 保存。

(12) 其他培养用液的配制：

20ug/ml 内皮生长因子，

注意事项：

1. 配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。

2. 安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45 微米和0.22 微米滤膜各一张，放置位置为0.45 的位于0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。

3. 配制RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH 值最终为7.2 ，可在配制时调PH 至7.4 。