细胞培养中死活细胞测定及细胞活力测定实验

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细胞培养 过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。

【实验原理】

(一)染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要体现在：

(1)死活细胞细胞膜 通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。

(2)死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。

常见的细胞染料有：中性红(细胞器 的专有染料)、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯(FDA)等。

① 中性红染色：常用染料之一，是细胞器的专有染料。利用细胞膜 的通透性差异，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。中性红无毒，常做活体染色的染料。

② 台盼蓝染色：当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜 ，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。

③ 美蓝染色法：美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞.

④ 甲基蓝染色法：甲基蓝染色与台盼蓝类似的染色机理。

(二)植物细胞质壁分离法及活体染色测定细胞死活

(1)质壁分离法：成长的植物细胞一般具有中央液泡，在中央液泡和细胞壁之间为细胞质的薄层及其内外膜——液泡膜和质膜。液泡中的胞液具有一定的溶质势(或称渗透势)，而活的原生质特别是液泡膜和质膜则具有半透性。所以，当细胞与外界溶液接触时，便与外液构成渗透系统，并可能发生水分的移动。若外液的水势低于胞液的溶质势，则水分外渗的结果可使原生质随着液泡一起收缩而脱离细胞壁，发生质壁分离，质壁分离的细胞与水或水势较高的溶液接触时，可重新吸水而是质壁分离复原。

(2)活体染色法：活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。中性红是常用的染料之一，它是一种弱碱性pH6.4～8.0之间(由红变黄)，在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。

【实验步骤】

1、 试剂的配置：

① 台盼蓝：4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。

② 中性红：先配成1%中性红水溶液(1克中性红溶于100毫升蒸馏水中)。取这种溶液1毫升，用0.6%生理盐水(或蒸馏水)稀释到50毫升，即成0.02%中性红水溶液，贮存在棕色瓶里，放在黑暗处。

③ 美蓝：取0.5克美蓝，溶于30毫升95%酒精中，加100毫升0.01%氢氧化钾溶液，保存在棕色瓶内。此溶液能染细胞核，还用来染细菌、血和神经组织等。

④ 甲基蓝：取1克甲基蓝，溶于29毫升70%酒精中，加入70毫升蒸馏水，即成1%甲基蓝染液。

2、 染色操作步骤：略

3、 细胞活力测定：染色过的细胞材料，放在显微镜下观察。凡未染或染色及浅的细胞是有活力的，而染色深的细胞是无活力的死细胞。

4、 按公式计算出细胞活力。 细胞活力(%)=未染色的细胞数/观察的细胞总数 X 100%

【注意事项】

1. 台盼蓝对人体有毒

2. 对细胞进行染色时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。