原代细胞培养实验

实验目的和要求：
掌握无菌操作技术。
了解小鼠解剖操作技术。
了解原代 细胞培养 的一般方法与步骤
了解培养细胞的消化分散。
了解细胞计数方法。
了解倒置显微镜的使用。

实验原理 ：

原代 细胞培养
是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。

实验内容：

动物的选择：
选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
每组小鼠胚胎1个

实验材料：
每组的超净台中有以下物品：
1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶
2. 100ml灭菌烧杯2个；
3、50ml离心筒2个
4、灭菌培养皿1个， 细胞培养 瓶1个
4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个
5、细胞计数板1块；
6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；
7、酒精灯1台；

试验操作步骤：
1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
a．采用认可的方案处死啮齿动物。
b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。
c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。
f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。
3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。
4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。
5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。

6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。
7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。
8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。
9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。