流式细胞术定量检测细胞凋亡3种方法的比较研究

细胞凋亡的定性检测依赖于形态学观察及DNA电泳,其定量检测则需借助于流式细胞检查。使用碘化丙啶(PI)染色检测DNA含量是最早出现的凋亡定量检测方法^［1］ 。进入90年代,检测DNA断裂点的TUNEL(Terminal deoxylnucleotidyl transferase mediated-dUTP nick end labeling)技术成为凋亡定量检测的主流。1995年Vermes 首次使用荧光素标记的膜联蛋白V(FITC- Annexin V)联合PI染色双参数技术定量检测凋亡，目前国内尚未见报道^［2］ 。我们同时使用上述3种方法对地塞米松处理的小鼠胸腺细胞进行凋亡检测对比研究，借以探讨这一新的方法的应用价值，现报道如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料 　4周龄雄性昆明小鼠12只。PI(Sigma)。TUNEL试剂盒(德国Boehringer Mannheim)。Annexin V/PI试剂盒(法国国际免疫公司)。流式细胞仪(FACScan型 美国BD公司)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　动物模型及细胞制备　10只小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg，2只小鼠腹腔注射生理盐水作为对照。10 h后取胸腺，网搓法分离胸腺细胞。PBS洗2遍后调细胞浓度2×10⁶ ml^-1 ，备用。

　　1.2.2　PI染色法　取2×10⁶ 细胞,加入80%冷乙醇，4℃ 30 min，PBS洗1次，加入PI 50 mg/ml，0.1%TritonX-100，0.1 mmol/L EDTA(Na)₂ ，RNase 50 μg/ml。置黑暗处1 h后检测。

　　1.2.3　TUNEL法　取2×10⁶ 细胞，1%多聚甲醛冰上固定15 min,离心去上清,70%冷乙醇固定24 h。然后按试剂盒说明操作。

　　1.2.4　Annexin V/PI法　 取490 μl细胞加入5 μl FITC-Annexin V及5 μl PI(浓度250 μg/ml)，混匀置冰浴暗处温育10 min，PBS洗2遍，上机分析。

　　1.2.5　流式细胞仪分析　 光源为488 nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光,每份标本收集10 000个细胞,然后在Macintosh650计算机上用相关软件分析数据,用HP-Deskjet 1600CM打印机打印结果。

　　2　结果

　　2.1 　PI检测法　在正常二倍体细胞DNA峰(G1峰)前出现一亚二倍体凋亡峰,称Ap峰(图1)。

　　2.2 　TUNEL检测法　 根据FITC-dUTP掺入量的多少区分正常及凋亡细胞(图2)。

　　2.3 　FITC-Annexin V/PI检测法　正常细胞FITC及PI均低染(FITC^- PI^- )，在流式细胞分析图上为R₁ 区细胞簇。凋亡细胞FITC高染而PI低染(FITC⁺ PI^- )，图上显示为R₂ 区细胞簇。死亡细胞FITC及PI均高染(FITC⁺ PI⁺ )，图上显示为R₃ 区细胞簇(图3)。

图1　PI染色法胸腺细胞FACS测定图

　　Fig.1　Cytometric diagram of PI staining of mouse thymocytes

图2　TUNEL法胸腺细胞FACS测定图

　　Fig.2　Flow cytometric diagram of mouse thymocytes using TUNEL assay

　　Note:A peak.normal cells;B peak.apoptotic cells

图3　Annexin V/PI 双参数法胸腺细胞FACS测定图

　　Fig.3　Flow cytometric diagram of Annexin V/PI staining of mouse thymocytes

　　Note:A peak.normal cells;B peak. apoptotic cells+necrotic cells;C peak. normal cells+apoptotic cells;D peak. necrotic cells;R₁ . normal cells;R₂ .apoptotic cells;R₃ . necrotic cells

　　2.4 　PI、Annexin V/PI、TUNEL 3种方法凋亡检出率对照组分别为0、13.12%、1.24%。地塞米松处理组分别为27.19%、32.28%、50.17%,三者之间均有显著差异(P＜0.01),Annexin V/PI法死亡检出率13.25%,其凋亡+死亡检出率为45.62%,与TUNEL法凋亡检出率无显著差异(P＞0.05)。

　　2.5 　相关分析发现TUNEL法凋亡检出率与Annexin V/PI法凋亡检出率两者相关系数0.63,P＜0.05，与Annexin V/PI法凋亡＋死亡检出率二者相关系数为0.7,P＜0.05。

　　3　讨论

　　近年来有关凋亡信号转导、基因调控等方面的研究已取得重大进展,但作为所有研究基础的凋亡定量检测技术却进展不大。选用何种凋亡检测技术已成为研究的关键。

　　凋亡定量检测常需借助流式细胞检查。最早出现且较为常用的流式细胞凋亡定量检测技术是PI染色法。细胞凋亡时DNA断裂成小片段，当细胞用乙醇、TrionX-100处理后，这些小片段从细胞内释放出来，使其DNA含量低于正常细胞的二倍体。用DNA结合染料PI染色后分析，可在G1峰前出现一亚二倍体峰即Ap峰。根据Ap峰的百分率可检测凋亡细胞数。在本组研究中PI法凋亡检出率为27.19%,显著低于TUNEL法及Annexin V/PI法。其检出率低的原因主要是凋亡早期尽管有DNA裂点形成，但尚未出现DNA片段的大量丢失，因此该法不能检出早期凋亡细胞。次要原因是发生于S期或G2 /M期的凋亡细胞，即使有DNA含量降低，其实际含量也不低于二倍体细胞所含的DNA。国内李莉报道采用与本文同一动物模型PI漏检率高达42.8%。此外PI法还存在错检，一部分坏死细胞碎片发生低荧光，位于二倍体峰前，造成PI法错检。据李莉报道错检率达21.3%，因此我们认为PI染色定量检测凋亡并不理想。

　　目前国内外最为常用的凋亡定量检测方法是检测DNA断裂点的TUNEL法。在TDT作用下将FITC-dUTP掺入DNA裂点的3′ -OH端上，根据其掺入量的多少计算凋亡细胞百分比。由于DNA断裂发生在凋亡早期，因此该法可检出早期凋亡细胞，具有较高灵敏性。但该法最大缺点是坏死细胞亦呈现TUNEL反应阳性，使其特异性降低^［3］ 。本研究TUNEL凋亡检出率为50.17%，显著高于其它二法。我们认为这既与其较高的灵敏性有关亦与其较低的特异性有关。为证实此点我们作了进一步研究,结果发现TUNEL凋亡检出率与Annexin V/PI中凋亡＋死亡检出率无显著差异，相关分析亦提示TUNEL凋亡检出率实际更能反映凋亡＋死亡检出率。

　　1992年Fadok 报道在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸(PS)迁移至细胞外侧^［4］ 。1995年Vermes利用对PS有高度亲合力的磷脂结合蛋白Annexin V检测凋亡细胞。由于坏死细胞PS亦暴露于外表使Annexin V结合阳性，因此必须同时采用PI这一坏死细胞染色阳性的DNA染料将坏死细胞区分出来。与PI法检测凋亡不同的是该法不需要固定细胞，因此凋亡细胞PI低染。本资料表明使用Annexin V/PI双参数法可将正常细胞、凋亡细胞、死亡细胞区分开来，其凋亡检出率更有特异性。细胞发生凋亡时膜上PS外露早于DNA断裂发生^［2］ ，因此该法检测早期凋亡优于TUNEL法及PI法。现已明确胸腺细胞可自发发生凋亡^［5］ ，但本资料对照组PI法未检出凋亡，TUNEL法检出率仅为1.24%，而Annexin V/PI法检出率13.12%,这亦证实该法可检出早期凋亡因而具有更大的灵敏性。该法另一优点是细胞不需要固定，避免了PI法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此更加省时，结果亦更为可靠。

　　综上所述,我们认为Annexin V/PI法既可检测早期凋亡,又可将凋亡及死亡细胞区分开来，较PI、TUNEL具有更高的灵敏性及特异性。且不需固定，省时省力，应是目前流式细胞仪定量检测凋亡的首选方法。

　　作者简介：郑骏年，男，32岁，泌尿外科硕士；

　　指导教师，谢叔良，男，教授，从事肿瘤及移植耐受研究

　　参考文献

　　1　Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci M C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry . J Immunol Methods， 1991;139:271

　　2　Vermes I, Haanen C, Steffens-Nakken H et al. A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptosis cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods，1995; 184:39

　　3　Gorczyca W, Gong J P, Darzynkiewicz Z.Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assay . Cancer Res，1993;53:1945

　　4　Fadok V A, Voelker D R,Campbell P A et al. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophage . J Immuol， 1992;148:2207

　　5　郭爱珍. 胸腺细胞的发育与凋亡.细胞与分子免疫学杂志， 1997；13(1):61