磷酸酰丝氨酸外化的流式细胞术检测细胞凋亡

由于 PS 外化同样存在于失去膜完整性的凋亡晚期细胞和坏死细胞，所以在对凋亡细胞进行流式细胞术分析时，同时应用只对失去膜完整性的细胞染色的活体染料，如碘化丙锭（PI），以区分早期凋亡细胞和凋亡晚期细胞及坏死细胞。

细胞发生凋亡时，膜上的 PS 外露早于 DNA 断裂发生，因此膜联蛋白 V 联合 PI 染色法检测早期细胞凋亡较 TUNEL 法更为灵敏。又因为膜联蛋白 V 联合 PI 染色不需固定细胞，可避免 PI 染色因固定造成的细胞碎片过多及 TUNEL 法因固定出现的 DNA 片段丢失。

因此，膜联蛋白 V 联合 PI 法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

磷酸酰丝氨酸外化的流式细胞术检测细胞凋亡的基本原理是磷脂酰丝氨酸（SP）分子通常只存在于细胞膜的内侧，在凋亡早期，细胞膜中 PS 分子自脂质双分子层的内层翻转至外层，形成 PS 外化。

膜联蛋白 V（annexin V）是一种分子质量为 35～36 kDa 的 Ca^2＋ 依赖性磷脂结合蛋白，对 PS 高度亲和，可通过外化的 PS 结合到凋亡的细胞表面。共轭有荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC）的膜联蛋白 V（annexin V FITC）同样保留了对 PS 的高度亲和，可以用作探针，对凋亡细胞进行流式细胞术分析。

器材：

① 流式细胞仪

② 10 mL 离心管

③ 微量移液器及其吸头

④ 5 mL 玻璃管

⑤ 400 目的筛网

⑥ HeLa 细胞（或其他细胞）。

试剂：

① 结合缓冲液

② 0.02％ EDTA

③ PBS

④ 膜联蛋白 V-FITC

⑤ 10x 结合缓冲液

（0.1 mol/L HEPES-NaOH，pH7.4；1.4 mmol/L NaCl；25 mmol/L CaCl₂（使用前稀释为 1x））

⑥ VP-16 100 mmol/L（-20 ℃ 储存）

磷酸酰丝氨酸外化的流式细胞术检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步：

A 培养细胞，诱导凋亡过程同前。

B 收集细胞，悬浮细胞直接收集。贴壁细胞先用滴管轻轻吹打，收集已脱落的细胞离心管。加入适量的 0.02％ EDTA（3～4 mL）消化未脱壁细胞并收集至上述离心管。1000 r/min 离心 5 min，弃上清液。

C 冷 PBS 洗细胞 2 次。

D 400 目的筛网过滤 1 次。

E 1x 结合缓冲液悬浮细胞，并调整细胞数至 1 x 10⁶ 个/mL。

F 取 100 μL 细胞悬液至一个 5 mL 玻璃管。

G 加入 5 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 10 μL PI［对照 1：省略步骤（4）；对照 2：只加膜联蛋白 V-FITC；对照 3：只加 PI］。

H 轻轻混匀，室温下避光孵育 15 min。

I 加入 400 μL 1x 结合缓冲液，即刻用流式细胞仪进行分析（亦可用荧光显微镜观察）。