【共享】免疫组化问题及解决办法

免疫组化问题及解决办法
1、染色过强
原因 解决办法
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗
体），抗体孵育时间：室温1小时或
4℃过夜
孵育温度过高，孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟，以显微
镜下观察为准

2、非特异性背景染色
原因 解决办法
操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
组织中含内源性生物素 正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间

3、染色弱
原因 解决办法
抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期 及时更换试剂
操作中，滴加试剂时缓冲液未沥 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液
干，致使试剂稀释 （但防止切片干燥）
室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵
育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟

4、染色阴性
原因 解决办法
操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照
组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果
一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误