小鼠组织切片免疫组化操作步骤

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如何实现完美的免疫组化实验

材料 二甲苯，酒精（100％，95％），EDTA抗原 修复工作液（pH8.0，稀释50倍使用），0.5M Tris-NaCl (TBS) pH7.4（稀释10倍使用）, DAB显色液（临用前配制：试剂盒A、B、C各50ul，于1ml水中混匀）。
方法 1. 石蜡切片置60℃烘箱中烘烤过夜2. 二甲苯中脱蜡，梯度酒精入水(无水乙醇，95％酒精)，浸泡于蒸馏水中待用3. 抗原修复 取500mlEDTA 抗原修复工作液于1000ml烧杯中，在小功率电炉上加热，至似沸微沸（为了防止脱片）。将组织切片缓慢放入烧杯。继续加热，保持液体在微沸状态20分钟。将烧杯移开火源，室温下自然冷却后取出切片，蒸馏水洗1次3分钟，TBS洗2次每次3分钟。4. 每张切片加一滴或50ul 3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min， 以阻断内源性过氧化物酶的活性。 TBS冲洗3次，每次3min。5. 除去TBS液，加一滴或50ul 一抗（灭活PLB免疫小鼠所得到的多抗，1:3000稀释），阴性对照采用普通血清， 室温下孵育2小时，或4℃过夜。6. TBS洗3次，每次5min，除去TBS液，每张切片加一滴或50ul polymer enhancer（试剂A）， 室温下孵育20min， TBS冲洗3次， 每次3min。7. 除去TBS液，每张切片加一滴或50ul 过氧化物酶标记的抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30min，TBS洗3次，每次3min。8. 除去TBS液，每张切片加一滴或50ul 新鲜配制的DAB，显色3－10min。9. 自来水冲洗，苏木素复染10min，水冲洗。0.1%的盐酸分化，自来水冲洗，TBS返蓝。10. 不需脱水，直接用中性树脂封片。
注意事项 1.抗原修复时必须保证切片始终能浸泡在液体内，一定要等工作液冷却后才能将切片取出

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