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免疫组化非特异性背景染色及控制手段

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一、非特异性染色的识别

常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处,坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性,均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

二、非特异性染色的原因

1. Ig 与 Fc 受体结合

多见于冰冻切片(特别是淋巴造血组织,淋巴细胞,单核细胞,组织细胞表面多),主要是和二抗反应,因为一抗一般稀释度均较大,因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体,所以石蜡切片不多见。

避免方法:

① 用以二抗相同种族的正常血清封闭切片;

② 用不含Fc段的抗体,但价格贵

(V区,C1区不含Fc段,用Pepsin消化)

2.静电吸附

抗体是一种带负电荷的球蛋白,容易和带正电荷的组织相结合,如胶原纤维。

避免方法:

① 尽量稀释一抗

② 降低抗体的电荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;

③ 用去垢剂 如triton-100处理切片。 Tween-20等;

3.二抗与组织中的Ig结合

如羊抗兔的二抗,二抗可以标本中(人)Ig发生交叉反应,科学上越接近的动物,交叉反应越

明显,如人与猴,兔与豚鼠。

避免方法:用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。

4.组织中残存醛基与Ig的结合

如醛类固定后未能彻底的冲洗,残流醛基可以和Ig结合。

避免方法:

①彻底冲洗;

② 0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗;

5.内源性过氧化物酶

红细胞,粒细胞的含量尤其高,镜下可以识别,不要将其当成阳性结果。

避免方法:

① 石蜡切片 0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片;

② 冰冻切片 3%双氧水处理切片5分钟(99:1)因为未经固定包埋,大部分酶未被破坏;

③ 对于骨髓涂片

最好用非过氧化物酶标记的抗体

如碱性磷酸酶(AP)



磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料



快兰(fast blue)或快红(fast red)

↓ ↓

兰色 红色

用明胶甘油封片,不能用含二甲苯的封片剂,溶于二甲苯。

6. 内源性生物素

以 24mg/ml 的卵白素封片15分钟;

7. 交叉反应

PcAb敏感性高,但特异性稍低,容易出现非特异性染色。

避免方法:

①尽可能稀释 抗体 ;

②尽可能用McAb;

三、 抗体 最大稀释度的求法

最大稀释度的目的:

1.节约、

2.特异性染色↑、非特异性染色↓(决定其最大稀释度)

棋盘法

如 稀释度

1:50,1;100, 1:150, 1;200

特异性染色 +++ ++ ++ +

非特异性染色 ++ + - -

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