【求助】PKC活性 ELISA试剂盒
丁香园论坛
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请问有无人用过assaydesigns公司的PKC Kinase Activity Assay Kit（cat NO:EKS-420A）?可否说一下应用的经验？注意事项等？还有，该试剂盒的说明书有几处地方不是很懂，请大家帮忙看一下：
1、To avoid cross contamination, change disposable pipette tips between the addition of each standard, sample, and reagent and add to the side of the wells. Use separate troughs/reservoirs for each reagent.——做ELISA时，加试剂不是应该直接加到底部的吗？怎么我看这里写的好像是要加到壁上。
2、Perform a time course using various kinase concentrations, including a no-enzyme blank, to confirm a linear response of the kinase with respect to phosphorylation.
——请问这一步具体怎么做的？说明书只说了这么一点。
3、The Active PKC (part# 80-1484) is intended to be used as a positive control and can be serially diluted in Kinase Assay Dilution Buffer to a final volume of 30μL. Please refer to the lot specific technical data sheet provided for the concentration (ng/μL) of the purified kinase preparation. Keep preparations on ice.——这里阳性对照的浓度大家是怎么定的？做多少孔阳性对照？
4、Incubate the plate at room temperature for 30-60 minutes (incubation time should be monitored by the investigator according to color development).——这里所说的 color development是不是指有无色变为有色或是由一种颜色变为另一种颜色？
5、大家裂解细胞的裂解液，用的是说明书上的配方还是用大家既往的配方？我看说明书上的配方裂解后只能收集胞浆的蛋白而不是全部蛋白。
问题有点多了。谢谢大家的帮助！
1、To avoid cross contamination, change disposable pipette tips between the addition of each standard, sample, and reagent and add to the side of the wells. Use separate troughs/reservoirs for each reagent.——做ELISA时，加试剂不是应该直接加到底部的吗？怎么我看这里写的好像是要加到壁上。
2、Perform a time course using various kinase concentrations, including a no-enzyme blank, to confirm a linear response of the kinase with respect to phosphorylation.
——请问这一步具体怎么做的？说明书只说了这么一点。
3、The Active PKC (part# 80-1484) is intended to be used as a positive control and can be serially diluted in Kinase Assay Dilution Buffer to a final volume of 30μL. Please refer to the lot specific technical data sheet provided for the concentration (ng/μL) of the purified kinase preparation. Keep preparations on ice.——这里阳性对照的浓度大家是怎么定的？做多少孔阳性对照？
4、Incubate the plate at room temperature for 30-60 minutes (incubation time should be monitored by the investigator according to color development).——这里所说的 color development是不是指有无色变为有色或是由一种颜色变为另一种颜色？
5、大家裂解细胞的裂解液，用的是说明书上的配方还是用大家既往的配方？我看说明书上的配方裂解后只能收集胞浆的蛋白而不是全部蛋白。
问题有点多了。谢谢大家的帮助！
说明书太大了，上传不了，需要的话我可以发到邮箱或者各位在网上载，assaydesigns公司网页就有。
怎么无人回啊？只好自己顶一下！
检测PKC活性可以用加拿大Immunechem公司的非放射性蛋白激酶C活性分析试剂盒，安全、快速、稳定，可用于筛选蛋白激酶C抑制剂或激活剂、定性定量分析纯化或部分纯化的PKC激酶活性。
测试盒原理：
基于ELISA的基本原理。PKC底物被包被在酶标板上，在ATP存在的前提下，PKC激酶将底物磷酸化，洗掉游离的PKC激酶和其他成分。再加入特异性磷酸化抗体（只识别磷酸化底物，而与非磷酸化底物无交叉反应。）检测残留在酶标板上的磷酸化底物。通过酶标二抗放大信号，读出OD值（蛋白激酶活性与OD值的对数成正比）。与对照组相比，得出处理组的蛋白激酶活性
（PKA, PKB, PKC, SGK, S6K和Tyrosine Kinase）等非放射性蛋白激酶分析测试盒http://www.immunechem.com
测试盒原理：
基于ELISA的基本原理。PKC底物被包被在酶标板上，在ATP存在的前提下，PKC激酶将底物磷酸化，洗掉游离的PKC激酶和其他成分。再加入特异性磷酸化抗体（只识别磷酸化底物，而与非磷酸化底物无交叉反应。）检测残留在酶标板上的磷酸化底物。通过酶标二抗放大信号，读出OD值（蛋白激酶活性与OD值的对数成正比）。与对照组相比，得出处理组的蛋白激酶活性
（PKA, PKB, PKC, SGK, S6K和Tyrosine Kinase）等非放射性蛋白激酶分析测试盒http://www.immunechem.com
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