(交流）大批量酶联免疫吸附检测术（ELISA）的简易做法

在现代生物医学研究及临床应用领域，酶联免疫吸附检测术（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）的使用越来越广。在免疫学研究中，常见的ELISA应用包括检测体液或培养液中抗原（如细胞因子）或抗体的浓度。虽然ELISA技术的操作流程因具体实验目的不同而有差异，其基本思路均是先将已知抗体（或抗原）固定于酶联反应板上，利用抗原-抗体特异性结合的特点，使待检测样本中相应的抗原（或抗体）联结在酶联板上，然后利用针对待检测抗体或抗原的抗体及随后的酶促反应，测定样本中抗原（或抗体）的浓度。操作过程中颇为费时费力的是各步之间的洗板过程。虽然目前有自动化洗板仪器商供，但普通实验室通常并不置备。在小规模的实验（如只有一块酶联板）中，手工向各反应孔中加入洗液（含0.05% Tween的PBS缓冲液）尚可行。但如有较大规模（如5-10块酶联板）实验，即使使用多道移液器吸加洗液也很易使人疲劳。本文以使用商业试剂盒检测人IL6和自行检测小鼠血清中抗体为例，介绍ELISA的一种简便操作方法。

人IL6检测试剂盒为eBioscience公司（San Diego, CA, USA）的Human IL6 ELISA READY-SET-GO 盒，商家推荐操作流程为：1用包被抗体包被酶联板（4度过夜）→2洗三遍（第I洗）→3加入阻断缓冲液（通常为含10%小牛血清或5%脱脂奶粉的洗液），室温下放置1小时→4洗三遍（第II洗）→5加入样本，室温下放置1小时→6洗五遍（第III洗）→7加入检测抗体（生物素标记），室温下放置1小时→8洗五遍（第IV洗）→9加入亲合素标记的HRP反应液，室温下放置半小时→10洗七遍（第V洗）→11加入酶底物显色→12终止反应→13用酶联仪读板。在此流程中前后共有五次洗板，总计23遍。商家推荐的洗板方法为向反应孔中加入300微升洗液，然后吸走。

作者在实际工作中发现，第I、II、III洗都可省略，每步反应（如包被、阻断、样本结合）后只需将反应液甩出，之后倒置在几层吸水草纸上用力扣拍三至五次（该步可称为扣板）。第IV洗只需一遍，但第V洗绝对不可缺减。洗板时，在适当容器内倒入洗液，将第一块酶联板内反应液如上甩弃、扣板后，将酶联板正向浸入洗液中，使洗液充满各反应孔（以及反应孔之间的空隙），然后将酶联板取出，放置一旁，再进行第二块酶联板。等所有酶联板充液后，回至第一块板重复操作。这种洗板方法（可称为漫洗法）虽然消耗较多的洗液且有一定程度浪费（因为洗液同时进入反应孔之间的空隙），但洗液能充满整个反应孔，且将整个酶联板内所有样本控制在同样的参数（如浸泡时间等）内，能保证洗板的质量。有秩序的浸板、甩板和扣板，操作简单、快捷，加之洗液本身成本极低，所以漫洗法非常有效、实用、快速。图A所示为使用前述试剂盒利用这种简化ELISA操作方法获得的标准曲线，若进行曲线回归分析，采用多数试剂盒推荐的双对数（LOG-LOG）或指数模型时，相关因子R分别等于0.988和0.998。事实上，如果待测样本稀释倍数合适，采用四参数回归模型能得到更精确的结果（如图A的四参数回归相关因子R等于1）。从此可以看出省略前面三次洗板并使用漫洗法洗板不会影响该方法的特异性和灵敏度。作者使用多个商家的多种细胞因子检测试剂盒，依照简化ELISA流程操作，所得结果均支持该结论。

理论上，各步之间洗板的唯一目的是消除未结合或非特异性地结合在酶联板上的试剂对后续反应的影响。只要在抗体（或抗原）包被反应孔后有充分的阻断时间（上述流程中第二步，作者建议用阻断缓冲液将反应孔充满并将放置时间延长至2小时），且在加入酶底物前有一次彻底的洗涤（第V洗，七遍），就能将非特异性结合带来的影响降至最低。这一观察在有些商家的试剂盒的操作中也得到明确的印证。比如在Golden Bridge International Inc（Lynnwood，WA，USA）提供的GB-CYTE Human IL6试剂盒使用说明中，将待测样本加入反应孔后，便立即直接将兔抗人IL6抗体加至样本孔中，之后放置三个小时，相当于将前述流程中的5、6、7步合在一起。而BD Pharmingen公司（San Diego，CA，USA）提供的Human IL6 ELISA SET操作说明中，则将生物素化的检测抗体和亲合素标记的HRP反应液预先混合后在加至洗过的反应孔中，相当于将前述流程中7、8、9步合在一起。

类似地，作者用ELISA方法检测鸡卵白蛋白（OVA）免疫小鼠后血清内抗OVA抗体滴度时所用的简化程序如下：酶联板用OVA包被过夜→扣板→加入阻断缓冲液，室温下放置2小时→扣板→加入倍比稀释后的血清样本，室温下放置2小时→扣板→加入HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc，CA，USA），室温下放置1小时→洗七遍（漫洗法）→加酶底物→终止反应→读板。同样获得非常好的结果（图B）。

（（（有两张图，但不知怎么贴上来）））