确保ELISA自动化检验的质量需注意的几个要点
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在20世纪90年代中期以前，我国血液ELISA检验主要靠手工操作。从20世纪90年代中期开始，逐步开始自动化。目前，不少采供血机构已实现血液ELISA检验的自动化。
1 正确认识检验自动化与检验质量的关系
人们通常认为，只要购置了自动化仪器，血液ELISA检验的质量自然就会得到保证。而实际上，拥有自动化仪器，只是具备了血液ELISA自动化检验的硬件设施。在保证ELISA自动化检验的质量方面还需注意以下几个要点：人员知识与素质、标本前处理、试剂准备、熟读仪器的英文使用说明书、熟练掌握并灵活运用仪器用户软件、精心维护自动化仪器［1］。
2 做好以下工作，确保血液ELISA自动化检验的质量
2.1 人员知识与素质1）扎实、过硬的血液ELISA检验基础知识和操作技能。2）对计算机、机械、电子与光电技术有比较深入的了解。3）勤于思考、不断钻研。在仪器的使用过程中，能随时观察其运行状况，密切注意电脑提示，出现故障及时处理。
2.2 标本前处理高质量的标本前处理，是保证血液ELISA自动化检验质量的重要前提。保证标本前处理的高质量的措施有：1）不抗凝血液标本，让血凝块收缩完全，使标本中非特异性物质得以充分包裹，减少非特异性反应所致的假阳性。2）使用抗凝血标本，便于离心分离。3）适当加大离心转速并延长离心时间，使标本离心分离更加彻底。4）离心后，检查标本的离心情况，防止血凝块、血细胞、纤维蛋白悬浮在血清（浆）中，避免全自动加样器向酶标板微孔中加入上述物质。这些物质一旦进入酶标板微孔，就会堵塞全自动酶标分析仪洗板头的吸液针，导致“吐板”，还会出现假阳性结果。5）在2—8℃冰箱储存的标本，室温平衡30min后，才能加样。
2.3 试剂准备 1）室温保证： 实验室需配备空调和暖气设施，保证室温在允许范围内。测量并记录室温。2）试剂平衡：从冰箱内取出试剂，打开试剂盒，取出各组分，在室温平衡30min后，才能开启各组分包装，开始使用。试剂的平衡方式、时间和效果，将直接影响试剂对弱阳性标本的检出能力。3）酶标板条码粘贴：将双联号的酶标板条码，一一对应地粘贴在酶标板和条码粘贴表上，并对酶标板手工编号，防止张冠李戴。4）批号记录与核对：在条码粘贴表上正确记录所用试剂的批号，并核对电脑软件中的批号，确保一致。5）酶标板检查：如果酶标板框架不规整、微孔条不平整，将影响标本的加样和酶标板洗板，导致“吐板”。板条上封有塑料薄膜的酶标板，如果薄膜去除得不干净，将影响洗板，出现假阳性。微孔内如果有塑料屑、泡沫渣、干燥剂颗粒等异物，将影响洗板，导致“吐板”或出现假阳性。
2.4 标本加样 1）严格避免拖带污染。全自动加样器的拖带污染既有阳性拖带污染，也有阴性拖带污染的可能。以HBsAg为例［1］，如果加样方向上相邻2个标本，前一个为高浓度的抗�HBs，后一个为HBsAg弱阳性。加了高浓度的抗�HBs标本后，如果全自动加样器加样针没洗干净，就去加HBsAg弱阳性的标本，由于抗原抗体结合作用，就很可能使本来是HBsAg弱阳性的标本变成HBsAg阴性。这对 输血安全是致命的威胁。2）仔细调整加样针进入酶标板微孔的深度和分配速度，保证加样时液体不溅出、不挂珠，确保加样准确。3）加样后，检查酶标板的加样情况：微孔中有无血细胞、血凝块、纤维蛋白，标本量是否足够，应变色的孔是否都已变色。如有异常，应及时手工处理，确保加样准确。
2.5 熟读全自动酶标分析仪的英文使用说明书英文使用说明书介绍了仪器的工作原理和使用注意事项，仪器和用户软件的使用方法，仪器的维护程序与方法，使用中可能出现的故障及可能的原因等。只有熟读它，操作者才会透彻而深刻地理解全自动酶标分析仪，也才有可能掌握并精通其使用方法与技巧。
2.6 熟练掌握并灵活运用全自动酶标分析仪用户软件使用全自动酶标分析仪，怎样既能保证检验质量，又能在尽量短的时间内检测更多酶标板的关键就在于能熟练掌握并灵活运用用户软件。在用户软件中，实验步骤的编制、试剂和洗液的指定、工作表的编制与优化等都与此密切相关。现以瑞士HAMILTON公司的FAME24/20全自动酶标分析仪（该仪器有15个控温孵育槽、5个常温孵育槽、2个洗板单元——1和2、3个试剂分配单元——1和2及终止，该仪器使用2�1版FAME用户软件）中使用两步法（洗板2次）、ELISA试剂（上海科华抗�HCV、抗�HIV，美国Ortho抗�HCV）为例，逐一进行介绍。
2.6.1 实验步骤的编制这是保证检验质量、编制FAME24/20工作表的基础。孵育、洗板、试剂分配速度和振荡对编制FAME24/20工作表有决定性影响［2］。1）孵育：由于孵育时间±1min的波动时间和37℃孵育温度±1℃的波动温度都是软件中的必选项，所以我们分别给孵育时间和37℃孵育温度赋予±1min的波动时间和±1℃的波动温度。经过观察，FAME24/20正常运行中的孵育时间和37℃的孵育温度都是准确的。2）洗板：选择“板洗”模式，浸泡时间设置为20s或25s，吸液高度设置为0�1mm，泵动力选择“高”。试验证明，“板洗”模式最节约时间，20s或25s的浸泡时间是充分的。0�1mm的吸液高度可使微孔内液体残留量在允许范围内。高的泵动力可获得好的洗板效果。3）试剂分配：吸取使用“中速”。分配：酶、OPD液使用“中速”，A液使用“快速”，B液、终止液使用“慢速”。这些试剂分配速度，既可保证加试剂时不溅出，也为扩大工作表容量，缩短进板时间奠定了基础。4）振荡：选择“低频”，时间设置为5s。试验证明，5s的低频振荡是充分的。
由于2�1版FAME用户软件不允许连续的两个分配步骤，因此，在加底物A液和B液这两个连续的分配步骤之间增加了一个振荡步骤，从而顺利完成实验步骤的编制（表1）。
2.6.2 试剂和洗液的指定这是能否用尽量短的时间在FAME24/20中进更多的两步法酶标板的主要决定因素之一。首先，应合理而平衡地指定洗液，将孵育时间相差较大的试剂的洗液指定到同一洗板单元。我们将科华抗�HCV和Ortho抗�HCV的洗液指定到洗板单元2，将科华抗�HIV的洗液指定到洗板单元1，就比较充分而平衡地使用了FAME24/20的两个洗板单元。其次，应根据洗液的位置合理而灵活地指定试剂的位置。通常将酶、底物A液或OPD液指定到与其洗液所在洗板单元相对应的分配单元，将底物B液和终止液指定到终止分配单元。但科华抗�HCV的底物OPD液却被灵活地指定到了终止分配单元，我们的目的就是力求避免科华抗�HCV底物OPD液的分配步骤与Ortho抗�HCV酶标板和后续的科华抗�HCV酶标板的洗板步骤在时间上的冲突。灵活指定某些试剂，能显著缩短两步法酶标板的进板时间，能有效增加两步法ELISA试剂工作表的容量［3］（表2）。
表1 3种ELISA试剂实验步骤的编制
|
实验步骤 |
条件 |
科华
抗�HCV
|
科华
抗�HIV
|
Ortho
抗�HCV |
|
1酶标板准备 |
时间（min）
|
2
|
2
|
2 |
|
2 孵育 |
温度（℃） |
37±1 |
37±1
|
37±1 |
|
|
时间（min） |
30±1
|
60±1 |
60±1 |
|
3 洗板
|
板洗模式（遍）
|
5 |
5 |
5 |
|
|
浸泡时间（s） |
25
|
25
|
20 |
|
4 加酶 （μl/孔）
|
|
100
|
100
|
200
|
|
5孵育 |
温度（℃） |
37±1 |
37±1 |
37±1
|
|
|
时间（min） |
30±1
|
30±1 |
60±1 |
|
6洗板 |
板洗模式（遍） |
5 |
5 |
5 |
|
|
浸泡时间（s）
|
25
|
25 |
20 |
|
7加底物A液
（μl/孔） |
|
-
|
50
|
-
|
|
8振荡（s）
|
|
-
|
5
|
-
|
|
9加底物
|
B液（μl/孔） |
-
|
50
|
- |
|
|
OPD液（μl/孔）
|
100
|
-
|
200 |
|
10孵育
|
温度（℃） |
37±1 |
37±1
|
室温 |
|
|
时间（min） |
10±1 |
10±1
|
30±1
|
|
11加终止液
（μl/孔）
|
|
50
|
50
|
50
|
|
12振荡（s）
|
|
5
|
5
|
5 |
|
13比色
|
测量波长（nm）
|
492
|
450
|
492 |
|
|
参考波长（nm） |
630
|
630
|
630 |
表2 3种ELISA试剂的洗液所指定的洗板单元和酶、底物、终止液所指定的分配单元
|
|
科华抗�HCV |
科华抗�HIV
|
Ortho抗�HCV
|
|
洗液 |
洗板单元2 |
洗板单元1
|
洗板单元2 |
|
酶
|
2 |
1 |
2
|
|
底物A液 |
- |
1 |
- |
|
底物B液
|
- |
终止
|
- |
|
底物OPD液 |
终止
|
-
|
2 |
|
终止液 |
终止
|
终止
|
终止
|
2.6.3 工作表的编制与优化［4］用HCV1、HIV和HCV2分别表示科华抗�HCV、抗�HIV和Ortho抗�HCV的进板板架，编制出下述工作表（表3）。
编制工作表的优化方法［5］：1）1个板架只编入1个酶标板。进板时也采用每次只进1个酶标板的单板进板模式，而不采用每次进多个酶标板的成组进板模式。用单板进板模式，容易编制出容量大、进板时间短的工作表。2）所有酶标板的最早开始时间设置为0min，让软件计算出每块酶标板实际的进板时间，有利于编制出进板时间比较合理的工作表。3）将孵育时间相对较短的部分酶标板放在前面进板，可扩大工作表容量并缩短进板时间。4）尽量将在不同洗板单元洗板的酶标板交叉进板，使FAME24/20的两个洗板单元能同时工作，提高仪器资源使用效率，缩短进板时间。
表3 15个两步法酶标板进板工作表
|
进板顺序 |
板架类型
|
实际进板时间（min） |
|
1 |
HCV1 |
0
|
|
2 |
HIV |
1
|
|
3 |
HCV1 |
3 |
|
4
|
HIV |
5 |
|
5
|
HCV2 |
11 |
|
6
|
HCV2 |
14
|
|
7 |
HCV2 |
18 |
|
8 |
HIV |
19
|
|
9
|
HCV1 |
27
|
|
10 |
HIV
|
28 |
|
11 |
HCV2
|
36
|
|
12 |
HCV2
|
39 |
|
13 |
HIV
|
43 |
|
14 |
HIV |
48 |
|
15
|
HCV1
|
53 |
注：运行时间：200min
2.7 精心维护ELISA自动化 检验仪器
2.7.1 全自动加样器的维护介绍我们对全自动加样器Microlab AT Plus 2（AT Plus 2）的维护：1）每周按照AT Plus 2用户软件sunplus的Maintenance程序全面维护1次。2）抬升试管的tube lifter的周围间隙很小，若玻璃渣等细小异物掉进去就难以升起来。此时，需拆开左右两个盖子，用改刀从tube lifter的底部将其抬上来，去除异物，清洁整个tube lifter。3）定期拆洗抓针爪套筒和内、外爪，整形或更换内、外爪，确保加样针良好的抓取效果。4）每12个月校验1次。
2.7.2 全自动酶标分析仪的维护介绍我们对FAME全自动酶标分析仪的维护：1）按FAME用户软件的维护程序，作冷启动维护和日、周、月维护。其中，我们强化了日维护，FAME每运行1次，就用约60℃的热蒸馏水日维护2次。这可延缓管路系统的结垢速度，延长FAME良好洗板状态的持续时间。2）做好仪器内部清洁，保证光电传感器和酶标仪能正常工作。洗板单元中酶标板下面的电路板须保持干燥，电路板上如果有水，将“吐板”。3）每半年拆洗1次管路系统：①拆洗洗液桶。②拆洗洗液泵和洗板机的进、出水软管，真空泵的出水软管。③拆洗洗板头。④日维护数次。拆洗FAME管路系统可彻底清除其中的污垢，恢复FAME良好的洗板状态，确保洗板的质量。4）每12个月校验1次［6］。
参考文献
［1］马宏伟，温涛，谢伟.STAR全自动加样器加酶引起HBsAg拖带阳性分析［J］.中国误诊学杂志，2007，7(8)：1719—1720
［2］李慧,惠永庆,刘世荣.酶联 免疫吸附试验全自动与手工操作方法比较. ［J］.中国输血杂志,2000,13(2):97—98
［3］李文.全自动酶标分析仪工作表的优化设计与应用［J］.中国输血杂志，2002，15(1)：42—43
［4］李文，丁显平，王乃红，等.FAME24/20中两步法ELISA试剂工作表的优化设计［J］.现代预防医学，2007，34(11)：2062—2064
［5］杨勇毅，王军，罗蓉.全自动酶免分析系统工作流程的优化［J］.中国输血杂志，2007，20(2)：134—135
［6］郑怀竞. 必须做好各级血站实验室 免疫学检验的室内全程 质量控制［J］.中国输血杂志，2002，15(5)：299—300
摘自《中国输血杂志》2008年第6期452-454页
