时间分辨荧光技术原理

荧光和均相性分析

理论上，荧光是最灵敏的检测手段。由于许多分子间和分子内的变化会改变标记物的荧光发射。因此，很早就把它作为均相分析技术可能的新的手段。偏振，淬灭，时间关联，荧光寿命改变以及荧光共振能量转移（ FRET）已经被广泛应用在对分子间作用的研究中 1-5 。

然而，在这些应用中，一些技术条件严重受限，包括低的调整幅度，来自于分析环境组分的的信号干扰，迅变的荧光背景，以及在分析环境中由蛋白、分子以及聚合物导致的光的散射。在这些技术中， FRET是项令人很感兴趣的技术。 Foster假定，能量传输速率是依赖于激发态供体与附近的受体分子间的距离 6 。

对于已知的供受体对，距离 R 0 (传输效率为50%的距离)在1-7nm的宽度。利用这些特性，可以将FRET作为一个光学标尺，来衡量生物大分子间的关系，这一点已经通过Stryer等人的先驱性工作 14 以及随后开展起来的研究证实了它的可行性 8-10 。

对于研究溶液中分子间距离和相互作用，仅仅有很少的技术具有可行性，因此， FRET技术得以应用到许多生物学领域，如酶活性 11 、蛋白-DNA相互作用 12 以及细胞表面外源凝集素诱导的受体和配体相互作用 13 。DNA杂交研究已经吸引了更多的注意力，它日益成为研究的焦点，因为它可以FRET原理研究、结构研究、寡核苷酸杂交或者基因转位 14-18 提供支持模型。因为，FRET的过程在抗原抗体相互作用后发生，由此，均相荧光分析技术广泛的开展起来 17-18 。最近，利用FRET监测受体的寡聚化，而受体的寡聚化是信号传导途径的关键步骤。最后，Tsien等人发展了新的荧光供体/受体指示剂，用以测量细胞膜表面电势，以及观测基因转录过程 20-21 。

然而，这些非常有吸引力的工作并不能掩盖挡在 FRET技术前面的困难。例如，因为它的自发荧光，所测的荧光强度必须被校正，未结合的发色团极大地的抑制了分析的灵敏性以及将后续的结果分析复杂化。如果滤掉供体/受体发射谱，又会导致对受体发出的长寿命的荧光信号探测的灵敏性下降。因此， CIS bio international发展了HTRF技术，这为深入而广泛地研究受体-供体对间的相互作用提供了可能性。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素的螯和标记物和XL665作为一个供配体对。HTRF技术的的特点包括发射光的特殊光谱特性以及可以选择时间分辨的监测模式。如图1，当荧光受体和供体紧密接触，供体受激发后，部分能量就转移给受体。所有这些特性组合，使得HTRF技术克服了FRET技术中的种种限制因素。

时间分辨荧光和稀土元素

在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。

由于稀土元素复合物的特殊的光物理和光谱特性，使之成为生物学中荧光应用的焦点 22-25 。稀土三价离子的电子云的结构，保护了一些处在活跃能级的电子，因此形成了自己特有的发射谱系。因此，依照量子机械定律，会一定程度上限制了电子的迁移，导致这类元素发生的荧光的衰减周期通常是很长的 (from μsec to msec) 。作为它的配对物，处于相同的原因，光的收集效率非常低。因此，稀土元素螯和物被设计成一个光吸收装置，用以吸收有序的部分。收集的能量靠分子间的非辐射途径，从单价态转到三价态，然后继续从三价态转换到稀土元素离子的发射能级水平，最终导致了长寿命荧光的产生 28 。

如果考虑将稀土复合物作为生物学检测中的荧光探针，那它就必须具有一些特性，如稳定性、可选择络合位、荧光的高量子产率以及与生物分子耦连的能力。此外，对荧光淬灭的灵敏度低是在生物流体中进行研究的必备条件。

实际上，这些条件并不是已知的稀土螯和物都能具备的。即使这些分子可以使用在均相分析中，但许多限制因素，如稳定性、具有螯和活性的竞争物、灵敏度，都是有待解决的问题。

荧光共振能量转移（ FRET）过程中的调节

CIS bio international发展的均相技术是基于Eu螯和物的供体与受体（第二荧光标记物）之间的荧光共振能量转移。受体的标记物是别藻蓝蛋白，是个105Kda的藻胆蛋白。它中间交联着一个经化学修饰过的的发色团XL665，其同样也显示了特有的光学物理性质，并能够与Eu 3+ 螯和物彼此匹配：1）对螯和物的发射光具有很高的摩尔吸收；2）在XL665的发射光的光谱范围内，螯和物对其的干扰是可以忽略的（图3）；3）很高的量子产率（大约70%在生物流体中不会被淬灭）。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。这是由于具有长衰减周期的TBP-Eu（供体）诱导了XL665受体的长时间的发射荧光。由于与供体TBP-Eu发生荧光共振能量转移，在XL665发射的波长范围内，激发后产生的荧光持续较长时间，这样就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。

Figure 3 : TPB Eu 3+ cryptate and

XL665 emission spectra

Figure 4 : fluorescence temporal selection at 665 nm.

Upon excitation, medium, non-engaged acceptor or

cryptate generate fluorescence at 665 nm, most of which

is discriminated by the time-resolved measurement.

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