实验57 核酸的测定
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实验57 核酸的测定
Ⅰ.方法一
原理
核酸在生物体内,尤其是在蛋白质合成方面具有重要的意义。通过对不同年龄植物的各组织内核酸含量的测定,能进一步加深对核酸生理功能的理解。
用过氯酸沉淀植物组织匀浆中的核蛋白,用醇醚除去其中的脂类后,以稀碱水解然后酸化,在低温条件下使RNA与DNA分离,制成RNA和DNA提取液,再根据核酸中碱基对紫外线的吸收,测定核酸的含量。
仪器药品
751型分光光度计 冰箱
冰冻离心机 研钵
移液管 试管
乙醚 盐酸
90%乙醇 过氯酸
氢氧化钠
操作步骤
1.称取0.1g鲜组织,在0─4℃条件下,迅速地添加2ml90%冷乙醇固定,磨碎。并分别以1ml90%乙醇将磨碎物洗2次至小离心管内。离心并以2ml90%乙醇洗1次,上层液定容至5ml,为叶绿素提取液。
2.向离心管沉淀物内添加2ml乙醇-乙醚溶液(3∶1,简称二乙),置冰箱中过夜。
3.取出离心之,并再以2ml二乙和2ml90%乙醇各洗1次,离心弃去上层液。
4.无脂沉淀物于冷处用冷的0.2mol/L过氯酸洗3次,每次2ml。上层液为酸溶性部分,加1ml 1mol/L NaOH于沉淀内,室温(25℃)下水解8小时,离心,以1ml 1mol/L NaOH洗2次,上层添加0.6ml 6mol/L HCl,使碱酸比为1ml∶0.2ml,溶液转呈酸性,置冰箱中过液。
5.次日离心之,用碱液中和洗沉淀2次,上层液为RNA部分,定容至25ml。
6.沉淀物加2ml 1 mol/L过氯酸,于75℃水解20分钟,离心,以1.5ml 1 mol/L过氯酸洗沉淀2次,上层液为DNA部分,定容至5ml。
7.RNA、DNA溶液可用分光光度计在波长260nm和265nm处测定吸光度A。如需要测定吸收曲线,可于230梍300nm波长区,每隔5梍10nm,测定吸光度A,然后绘制A-波长nm图。
8.以已知浓度的标准RNA和DNA在260nm和265nm下测得A,然后根据下式计算核酸的含量。
式中Cx 为样品中RNA(DNA)的浓度,μg/ml,
Cs 为标准RNA(DNA)的浓度,μg/ml,
Ax 为样品中RNA(DNA)的吸光度,
As 为标准RNA(DNA)的吸光度。
(北京师范学院赵微平)
Ⅱ.方法二
原理
核酸的紫外吸收性质是核酸分析中极为重要的特性。Logan等发现RNA和DNA相同浓度的吸收曲线在268.5nm处相交,此处两种核酸的ε(p)值为9850,利用核酸的这一光学特性,可以方便地测定溶液中核酸的含量。
仪器药品
751型分光光度计 离心机
真空干燥器 恒温水浴锅
台天平 研钵
移液管 氯仿
5%过氯酸 5%三氯乙酸
乙醇 乙醚
操作步骤
1.称取新鲜组织0.1g,加5%过氯酸1ml,用研钵于0℃下研磨成匀浆,3000r/min离心10分钟,弃去上清液。
2.如上述同样方法,用5%过氯酸提取2次,以完全除去酸溶蛋白。
3.残渣用乙醇-乙醚-氯仿(2:2:1)混合液,于室温下提取4次,每次提取15分钟,以除去磷脂。经离心后,弃去上清液。
4.核酸残渣于睦空干燥器中干燥之。
5.干燥残渣加0.5ml5%三氯乙酸,放在90℃恒温水浴中水解30分钟。
6.三氯乙酸水解液,于分光光度计268.5nm波长下,测定吸光度。以在同样条件下(90℃,30分钟)处理过的5%三氯乙酸作为空白对照。石英比色杯的光径为1cm。
7.根据(p)=9850,用下式计算核酸含量:
式中C为磷浓度(g/L),A268.5 为样品在波长268.5nm下测得的吸光度。
(p)称为磷原子的吸收系数。由于核酸样品颗粒的重量很难精确测定,因此对不同来源及不同纯度的制剂作比较时,常用磷原子吸收系数
8.如果需要分别测定DNA和RNA时,可以用二苯胺反应,以测定三氯乙酸水解液中的DNA,再从总的核酸含量中减去DNA,即得DNA含量。