实验57 核酸的测定

实验57 核酸的测定

Ⅰ．方法一

原理

　　核酸在生物体内，尤其是在蛋白质合成方面具有重要的意义。通过对不同年龄植物的各组织内核酸含量的测定，能进一步加深对核酸生理功能的理解。

　　用过氯酸沉淀植物组织匀浆中的核蛋白，用醇醚除去其中的脂类后，以稀碱水解然后酸化，在低温条件下使RNA与DNA分离，制成RNA和DNA提取液，再根据核酸中碱基对紫外线的吸收，测定核酸的含量。

仪器药品

　　751型分光光度计　　　 　 冰箱

　　冰冻离心机　　　　　　　 研钵

　　移液管 　　　　　　　　　试管

　　乙醚 　　　　　　　　　　盐酸

　　90%乙醇 　　　　　　　　 过氯酸

　　氢氧化钠

操作步骤

　　1．称取0.1g鲜组织，在0─4℃条件下，迅速地添加2ml90%冷乙醇固定，磨碎。并分别以1ml90%乙醇将磨碎物洗2次至小离心管内。离心并以2ml90%乙醇洗1次，上层液定容至5ml，为叶绿素提取液。

　　2．向离心管沉淀物内添加2ml乙醇－乙醚溶液（3∶1，简称二乙），置冰箱中过夜。

　　3．取出离心之，并再以2ml二乙和2ml90%乙醇各洗1次，离心弃去上层液。

　　4．无脂沉淀物于冷处用冷的0.2mol/L过氯酸洗3次，每次2ml。上层液为酸溶性部分，加1ml 1mol/L NaOH于沉淀内，室温(25℃)下水解8小时，离心，以1ml 1mol/L NaOH洗2次，上层添加0.6ml 6mol/L HCl，使碱酸比为1ml∶0.2ml，溶液转呈酸性，置冰箱中过液。

　　5．次日离心之，用碱液中和洗沉淀2次，上层液为RNA部分，定容至25ml。

　　6．沉淀物加2ml 1 mol/L过氯酸，于75℃水解20分钟，离心，以1.5ml 1 mol/L过氯酸洗沉淀2次，上层液为DNA部分，定容至5ml。

　　7．RNA、DNA溶液可用分光光度计在波长260nm和265nm处测定吸光度A。如需要测定吸收曲线，可于230梍300nm波长区，每隔5梍10nm，测定吸光度A，然后绘制A－波长nm图。

　　8．以已知浓度的标准RNA和DNA在260nm和265nm下测得A，然后根据下式计算核酸的含量。

　　式中C_x 为样品中RNA(DNA)的浓度，μg/ml，

　　C_s 为标准RNA(DNA)的浓度，μg/ml，

　　A_x 为样品中RNA(DNA)的吸光度，

　　A_s 为标准RNA(DNA)的吸光度。

（北京师范学院赵微平）

Ⅱ．方法二

原理

　　核酸的紫外吸收性质是核酸分析中极为重要的特性。Logan等发现RNA和DNA相同浓度的吸收曲线在268.5nm处相交，此处两种核酸的ε(p)值为9850，利用核酸的这一光学特性，可以方便地测定溶液中核酸的含量。

仪器药品

　　751型分光光度计 　　　　　　　 　离心机

　　真空干燥器 　　　　　　　　　　　恒温水浴锅

　　台天平 　　　　　　　　　　　　　研钵

　　移液管　　　　　　　　　　　 　　氯仿

　　5%过氯酸 　　　　　　　　　　　　5%三氯乙酸

　　乙醇　　　　　　　　　　　　　　 乙醚

操作步骤

　　1．称取新鲜组织0.1g，加5%过氯酸1ml，用研钵于0℃下研磨成匀浆，3000r/min离心10分钟，弃去上清液。

　　2．如上述同样方法，用5%过氯酸提取2次，以完全除去酸溶蛋白。

　　3．残渣用乙醇－乙醚－氯仿(2:2:1)混合液，于室温下提取4次，每次提取15分钟，以除去磷脂。经离心后，弃去上清液。

　　4．核酸残渣于睦空干燥器中干燥之。

　　5．干燥残渣加0.5ml5%三氯乙酸，放在90℃恒温水浴中水解30分钟。

　　6．三氯乙酸水解液，于分光光度计268.5nm波长下，测定吸光度。以在同样条件下（90℃，30分钟）处理过的5%三氯乙酸作为空白对照。石英比色杯的光径为1cm。

　　7．根据(p)=9850，用下式计算核酸含量：

　　式中C为磷浓度(g/L)，A_268.5 为样品在波长268.5nm下测得的吸光度。

　　(p)称为磷原子的吸收系数。由于核酸样品颗粒的重量很难精确测定，因此对不同来源及不同纯度的制剂作比较时，常用磷原子吸收系数

　　8．如果需要分别测定DNA和RNA时，可以用二苯胺反应，以测定三氯乙酸水解液中的DNA，再从总的核酸含量中减去DNA，即得DNA含量。