染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）
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一、概述
染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是一种用于分析基因组中特定染色体区域中组蛋白乙酰化状态的实验方法。众所周知，真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是DNA。DNA通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制 —— “组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧基端修饰的确定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类：如组氨酸乙酰转移酶（HATs）可以将乙酰基团转到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上的乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程，它可以作为调节因子的作用位点，也可以用来改变染色质结构。
尽管胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。而ChiP技术是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白（尤其是组蛋白）的修饰状态，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。ChiP技术有助于阐明组蛋白所发生的各种修饰在转录调控中的作用，亦可被用于调查某一转录因子所调控的基因。借助于ChiP及其相关基因分析技术的研究发现，具转录活性的基因的启动子区中H3、H4组蛋白多呈高乙酰化状态，而编码区及启动子上游区则缺少高乙酰化的组蛋白。
二、方法学
ChiP技术的基本流程如图21-1所示，其中用超声波切割经甲醛交联的染色质这一步非常关键，通常要求切割后的DNA长度应在200－1000bp（以3个核小体左右大小为宜）。目前，已有商品化的试剂盒出售。下文仅以Upstate公司（http://www.upstate.com）生产的ChiP试剂盒为例简要介绍ChiP技术的实验过程。
（一）主要试剂
1、SDS 裂解缓冲液 （1% SDS，10 mM EDTA，50 mM Tris , pH 8.1）
2、37％甲醛贮液
3、PMSF, 胃酶抑素A (1 mg/ml，100% MeOH溶解), 亮酞酶素 (1mg/ml ，蒸馏水溶解) 贮液
4、HEPES／山梨糖醇（20 mM HEPES, pH 7.4；1.2 M 山梨糖醇）
5、HEPES／山梨糖醇（20 mM HEPES, pH 6.8；1 mM MgCl 2 ；1.2 M 山梨糖醇）
6、LiCl／去污剂洗液（0.25 M LiCl；1% NP-40；1% DOC；1 mM EDTA；10 mM Tris-HCl, pH 8.1）
7、5 ×蛋白酶K缓冲液（50 mM Tris；25 mM EDTA；1.25 % SDS）
8、TE，pH 8.0
9、珠子洗脱缓冲液（1% SDS/0.1 M NaHCO 3 ）
10、低盐（Triton/HEPES）洗液（0.25% Triton X-100；10 mM EDTA；0.5 mM EGTA；10 mM HEPES, pH 6.5）
11、高盐（NaCl/HEPES）洗液（200 mM NaCl；1 mM EDTA；0.5 mM EGTA；10 mM HEPES, pH 6.5）
12、ChiP稀释缓冲液 ( 1:9 稀释)（0.01% SDS；1.1% Triton X 100；1.2 mM EDTA；16.7 mM TRIS, pH 8.1；167 mM NaCL）
13、PBS
14、超声处理过的λDNA，加入0.1%叠氮化钠，4°C 贮存
15、蛋白A琼脂糖珠子缓冲液（25 mL TE；25 mg BSA ；25µl 10 %叠氮化钠）
16、蛋白酶K溶液（18.6 mg/ml）
图 4-1 ChiP 技术的示意图
染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是一种用于分析基因组中特定染色体区域中组蛋白乙酰化状态的实验方法。众所周知，真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是DNA。DNA通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制 —— “组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧基端修饰的确定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类：如组氨酸乙酰转移酶（HATs）可以将乙酰基团转到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上的乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程，它可以作为调节因子的作用位点，也可以用来改变染色质结构。
尽管胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。而ChiP技术是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白（尤其是组蛋白）的修饰状态，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。ChiP技术有助于阐明组蛋白所发生的各种修饰在转录调控中的作用，亦可被用于调查某一转录因子所调控的基因。借助于ChiP及其相关基因分析技术的研究发现，具转录活性的基因的启动子区中H3、H4组蛋白多呈高乙酰化状态，而编码区及启动子上游区则缺少高乙酰化的组蛋白。
二、方法学
ChiP技术的基本流程如图21-1所示，其中用超声波切割经甲醛交联的染色质这一步非常关键，通常要求切割后的DNA长度应在200－1000bp（以3个核小体左右大小为宜）。目前，已有商品化的试剂盒出售。下文仅以Upstate公司（http://www.upstate.com）生产的ChiP试剂盒为例简要介绍ChiP技术的实验过程。
（一）主要试剂
1、SDS 裂解缓冲液 （1% SDS，10 mM EDTA，50 mM Tris , pH 8.1）
2、37％甲醛贮液
3、PMSF, 胃酶抑素A (1 mg/ml，100% MeOH溶解), 亮酞酶素 (1mg/ml ，蒸馏水溶解) 贮液
4、HEPES／山梨糖醇（20 mM HEPES, pH 7.4；1.2 M 山梨糖醇）
5、HEPES／山梨糖醇（20 mM HEPES, pH 6.8；1 mM MgCl 2 ；1.2 M 山梨糖醇）
6、LiCl／去污剂洗液（0.25 M LiCl；1% NP-40；1% DOC；1 mM EDTA；10 mM Tris-HCl, pH 8.1）
7、5 ×蛋白酶K缓冲液（50 mM Tris；25 mM EDTA；1.25 % SDS）
8、TE，pH 8.0
9、珠子洗脱缓冲液（1% SDS/0.1 M NaHCO 3 ）
10、低盐（Triton/HEPES）洗液（0.25% Triton X-100；10 mM EDTA；0.5 mM EGTA；10 mM HEPES, pH 6.5）
11、高盐（NaCl/HEPES）洗液（200 mM NaCl；1 mM EDTA；0.5 mM EGTA；10 mM HEPES, pH 6.5）
12、ChiP稀释缓冲液 ( 1:9 稀释)（0.01% SDS；1.1% Triton X 100；1.2 mM EDTA；16.7 mM TRIS, pH 8.1；167 mM NaCL）
13、PBS
14、超声处理过的λDNA，加入0.1%叠氮化钠，4°C 贮存
15、蛋白A琼脂糖珠子缓冲液（25 mL TE；25 mg BSA ；25µl 10 %叠氮化钠）
16、蛋白酶K溶液（18.6 mg/ml）
图 4-1 ChiP 技术的示意图
