土壤微生物分离纯化及测数

一、实验目的要求
1 了解土壤微 生物 的分离纯化及测数的基本原理。
2 学习并掌握微 生物 分离纯化技术方法。
3 学习并掌握微生物平板菌落计数的技术方法。

二、基本原理
土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。基本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。

三、实验步骤
（一）土壤样品采集
在待测田块上，若田块面积小于50平方米则按对角线三点采样，若田块面积大于50平方米按对角线五点采样。采样一般定点于耕作层0--20cm，先除去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。
（二）好气性细菌的分离纯化及测数
1.制备土样稀释液
吹吸三次混匀
无菌操作

另留一管不稀释留作对照（CK）

2.培养基的准备
融化牛肉膏 蛋白胨 培养基，融化后保温在48℃。并取6个无菌培养皿，分别在皿底贴好标签，注明10 ^-5 、10 ^-6 、CK（每个稀释度要两个平行皿，对照要两个平行皿）。

3.倾注法接种
先按10 ^-6 ，10 ^-5 的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每个平皿倾注约15 ml的牛肉膏 蛋白胨 培养基（48℃）待冷凝，混合均匀。

4.保温培养
将已经接种的平皿静置10min后，放入温箱倒置培养3--5日（30℃），观察结果。

5.分区划线法纯化
平板划线分离，其划线方法有以下两种：

6.计数
要求30~300之间计数。CK除外。

每克湿土样细菌数量
＝平均菌落数×稀释倍数
土壤样品水分系数
＝1∕（1—样品水分百分数）
土壤样品细菌数量（个∕克干土）
＝每克湿土样细菌数量×样品水分系数

四实验报告及思考题
1记录计数结果并计算土壤样品含菌数。
2平板菌落计数的结果是土壤样品实际含菌数？
3 比较平板菌落计数与显微镜直接计数的异同，它们各有何优缺点