大鼠磷酸化AKT蛋白(AKT)ELISA试剂盒 说明书
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大鼠磷酸化 AKT 蛋白 (AKT)ELISA 试剂盒
( 用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内 )
原理
本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA 法。用抗大鼠 AKT 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 AKT 与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠 AKT ，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在 450nm 处测 OD 值， AKT 浓度与 OD 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中 AKT 浓度。
试剂盒组成 （ 2-8℃ 保存）
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酶标 板（ Coated Wells ） |
96 孔 |
酶标抗体工作液（ Enzyme Conjugate ） |
12ml |
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10 ×标本稀释液（ Sample Buffer ） |
12ml |
20 ×浓缩洗涤液（ Wash Buffer ） |
50ml |
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标准品（ Standards ）： 100 uM / 瓶 |
2 瓶 |
底物工作液（ TMB Solution ） |
12ml |
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第一抗体工作液（ Biotinylated Antibody ） |
12ml |
终止液 （ Stop Solution ） |
12ml |
准备试剂与收集血样
1. 收集标本：血清、血浆（ EDTA 、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测， 2-8℃ 保存 48 小时；更长时间须冷冻（ -20 ℃ 或 -70 ℃ ）保存，避免反复冻融。
2. 标准品液配制：使用前加入 0.5ml 蒸馏水 混匀，配成 200 uM/L 的溶液 。 设标准管 8 管，第一管加标本稀释液 900ul ，第二至第八管加入标本稀释液 500ul 。在第一管中加入 200 uM/L 的标准品溶液 100ul 混匀后用加样器吸出 500ul ，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出 500ul 弃去。第八管为空白对照。
3. 10 ×标本稀释液用蒸馏水作 1:10 倍稀释（ 示例： 1ml 浓稀释液 +9ml 蒸馏水）。
4. 洗涤液：用重蒸水 1:20 稀释（示例： 1ml 浓缩洗涤液加入 19ml 的重蒸水）
检测程序
1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品 100ul ，将反应板充分混匀后置 37 ℃ 120 分钟。
2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干。
3. 每孔中加入第一抗体工作液 100ul 。将反应板充分混匀后置 37 ℃ 60 分钟。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶标抗体工作液 100ul 。将反应板置 37 ℃ 30 分钟。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液 100ul ，置 37 ℃ 暗处反应 15 分钟。
8. 每孔加入 100ul 终止液混匀。
9. 30 分钟内用酶标仪在 45 0nm 处测 吸光值。
结果计算与判断
1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行计算。
2. 以标准品 20 、 10 、 5 、 2.5 、 1.25 、 0.625 、 0.312 、 0 uM/L 为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。
3. 根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 AKT 含量。
试剂盒性能
1. 灵敏度 ： 最小的 AKT 检测浓度小于 0.2 uM/L 。
2. 特异性： 可同时检测重组或天然的大鼠 AKT 。 不与 大鼠其它细胞因子有交叉反应。
3. 重复性：板内、板见变异系数均小于10.3 ％。
注意事项
1. 以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。
2. 洗涤过程 很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及 OD 值错误地升高。
3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥 。
4. 本试剂盒宜置 4o C 冰箱保存。
4. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！
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