原位杂交实验操作步骤

探针的原理及其应用

一 质粒制备

1 质粒的转化和扩增

1.1 制备XL1-Blue感受态细菌

1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌 ，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。

2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒 DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。

3.轻轻摇匀，冰浴30min。

4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。

5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。

6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。

1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落

1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol/LEDTA(pH8.0)。

2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。

3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。

4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。

5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。

6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。

7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。

1.3质粒的扩增和纯化

1.用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苄青霉素(50μg/ml)培养液的聚丙烯管中，于37℃，200转/分培养3h。

2.将菌液转入含70mlLB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37℃，200转/分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。

3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170μ/ml)。37℃，200转/分培养12-16h。

4.将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4℃离,th,15min，沉淀细菌。

5.弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5min

6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10min。

7.加入预冷的溶液III3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10min，出现白色絮状沉淀。

8.6000rpm，4℃离心15min，保留上清。

9.将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10min。(或-20℃4h，或4℃过夜，可便核酸沉淀)

10.12000rpm，4℃离心15min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。

11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5mlEppendorf管中。

13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600μl，充分混匀。12000rpm，4℃离心15min，以沉淀高分子量的RNA。

14.将上清转移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。

15.12000rpm,4℃离心15min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。

16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另-1.5mlEppendorf管中，室温放置1.5mlEppendorf管中30min。

18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L)，混匀，4℃12000rpm离心5min以回收质粒DNA，弃去上清。

19.加入400μlTE缓冲液(pH8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。

20.将水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积(大约1ml)的无水乙醇，充分混匀后于4℃放置30min。

21.于4℃12000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。

22.加入400μl处于4℃的70%乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4℃12000rpm离心2min。

23.吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。

24.用100μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀。

25.取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280对DNA而言其值大约为

1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。;DNA浓度=OD260X0.05X稀释倍数(μg/μl)。

26.质粒DNA溶液于-20℃保存待用。

二、cRNA探针的标记

1.将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。

2.线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。

3.进行体外转录，步骤如下：

4.在冰上将各试剂加入一1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中。

三、原位杂交

3.1 冰冻切片与杂交前预处理

1. 将子宫样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时)，保存于-70 ℃冰柜备用。

2. 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。

3. 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。

4. 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。

5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。

6. 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA(乙酸酐/三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。

(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)

7. 5 x SSC中平衡15 min。

3.2 杂交

8. 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl/玻片)，置于放有湿盒液(50%甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，55～58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。

9. 甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng/μl)经70 ℃变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60μl/玻片)，

覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58 ℃下杂交18-30 h。

3.3杂交后处理

1O.取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 ℃预热的5×SSC洗30 min。

11.在无DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。

12.分别依次用52 ℃预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。

3.4 杂交信号检测

13.在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。

14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：500～1:2000稀释于含0.5%阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。

15.用缓冲液A洗2次，每次15 min。

16.在缓冲液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。

17.硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染

液在湿盒中显色过夜。

18.充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。

19.在95%乙醇中洗l h以除去非特异的背景。

20.用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。

21.脱水、透明，用中性树胶封片。

22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。