AnnexinV/PI双染凋亡细胞检测protocol

annexinＶ-FITC(FL1 通道)+ PI（FL2通道）双染细胞，FITC阳性＋PI阴性细胞百％就是早期凋亡％。

一、原理

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin V 进行荧光素（FITC、PE）或Biotin 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

二、方法

1、调整待检测细胞浓度为106个/ml，取200ul， 1000rpm×5min(4℃)。

2、预冷的PBS1ml 润洗两次2，1000rpm×5min(4℃)。

3、将细胞重悬于100ul binding buffer，加入2ulAnnexin-V-FITC(20ug/ml)，轻轻混匀，避光冰上放置15分钟。

4、转至流式检测管，加入400ulPBS，每个样品临上机前加入1ulPI（50ug/ml），2分钟后迅速检测。

5、同时以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作为阴性对照。

三、注意事项

1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测

四、结果判定

以AnnexinV为横轴，PI为纵轴；

左上象限为机械性损伤细胞；

右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞；

左下为阴性正常细胞；

右下为早期凋亡细胞。