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脯氨酸含量的测定

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在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻),植物体内脯氨酸(proline,Pro)的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程,因而能降低冰点,有防止细胞脱水的作用。在低温条件下,植物组织中脯氨酸增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。

一、原理

用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料:待测植物(水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等)叶片。

(二)仪器设备:1. 722型分光光度计;2. 研钵;3. 100ml小烧杯;4. 容量瓶;5. 大试管;6. 普通试管;7. 移液管;8. 注射器;9. 水浴锅;10. 漏斗;11. 漏斗架;12. 滤纸;13 剪刀。

(三)试剂1. 酸性茚三酮溶液:将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中,搅拌加热(70℃)溶解,贮于冰箱中;2. 3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml;3. 冰醋酸;4. 甲苯。

三、实验步骤

1. 标准曲线的绘制

(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸,倒入小烧杯内,用少量蒸馏水溶解,然后倒入250ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液中每ml含脯氨酸100μg。

(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶,分别盛入脯氨酸原液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5及3.0ml,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,各瓶的脯氨酸浓度分别为1,2,3,4,5及6μg/ml。

(3)取6支试管,分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30min。

(4)冷却后各试管准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。

(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520nm波长处进行比色。

(6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式,再按回归方程式绘制标准曲线,计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg/2ml)。

2. 样品的测定

(1)脯氨酸的提取:准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g,分别置大管中,然后向各管分别加入5ml3%的磺基水杨酸溶液,在沸水浴中提取10min,(提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液。

(2)吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中,加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色。

(3)冷却后加入4ml甲苯,摇荡30S,静置片刻,取上层液至10ml离心管中,在3000rpm下离心5min。

(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。

四、结果计算根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2ml测定液中脯氨酸的含量(Xμg/2ml),然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下:

脯氨酸含量(μg/g)=[X×5/2]/样重(g)。

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