原理
在正常环境条件下生长的植物,体内游离脯氨酸的含量较低,但在逆境(如旱,寒,盐等)条件下,植物体内游离脯氨酸的含量可增加10-100倍,因此有人提出游离脯氨酸的含量可作为植物抗逆性指标。
植物体内的游离脯氨酸用磺基水杨酸或酒精提取。在酸性条件下,脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色产物,用比色法于520n M 波长下测定脯氨酸的含量。
植物体内的游离脯氨酸用磺基水杨酸或酒精提取。在酸性条件下,脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色产物,用比色法于520n M 波长下测定脯氨酸的含量。
材料与仪器
小麦
酸性茚三酮 脯氨酸标准溶液 冰醋酸 甲苯
分光光度计 分析天平 恒温水浴 研钵 容量瓶 具塞试管 移液管 漏斗 滤纸
酸性茚三酮 脯氨酸标准溶液 冰醋酸 甲苯
分光光度计 分析天平 恒温水浴 研钵 容量瓶 具塞试管 移液管 漏斗 滤纸
步骤
一、仪器设备
分光光度计,分析天平,恒温水浴 ,研钵 ,容量瓶,具塞试管,移液管,漏斗,滤纸
具塞试管:25毫升9支
移液管:2毫升4支,5毫升2支
二、试剂
1.酸性茚三酮:称取2.5克茚三酮,加入60毫升冰醋酸和40毫升6 M 磷酸,于70℃下加热溶解。冷却后贮于棕色试剂瓶中备用。4℃下2~3日内有效。
2.脯氨酸标准溶液:称取0.0250克脯氨酸,溶解在250毫升蒸馏水中,其浓度为100微克/毫升。再取此液10毫升,用蒸馏水稀释至100毫升,即为10微克/毫升之脯氨酸标准液。
3.冰醋酸
4.甲苯
若用磺基水杨酸提取,需要配制3%的磺基水杨酸溶液。(若用酒精提取,需要80%的酒精,活性炭,人造沸石)。
三、材料
生长在灌水及干旱条件下的小麦或其它作物。
四、方法步骤
1.制作标准曲线:取7支25毫升具塞试管,编号。分别向各管准确加入 脯氨酸标准液(每毫升含脯氨酸10微克)0,0.2,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0毫升,再用蒸馏水将体积补至2毫升,摇匀,便配成了分别含0,2,4,8,12,16,20微克脯氨酸的标准系列。再向各管加入冰醋酸和酸性茚三酮各2毫升。摇匀后,在沸水浴中加热显色30分钟,取出后冷却至室温,向各管加入5毫升甲苯,充分摇动,以萃取红色产物。萃取完后(避光静置4小时以上),待完全分层后,用吸管吸取甲苯层,用分光光度计在520n M 波长下测定消光值,以脯氨酸含量为横座标,消光值为纵座标,绘制标准曲线。
2.游离脯氨酸提取:植物体内的游离脯氨酸可以用3%的磺基水杨酸提取。磺基水杨酸提取:称取新鲜和萎蔫小麦叶片各0.5克,将称好的样品放入具塞试管中,加入5毫升3%的磺基水杨酸溶液,将试管浸入沸水浴中提取15分钟,过滤,滤液待测。
3.测定:吸取滤液2毫升于试管内,与标准浓度的脯氨酸系列溶液同法显色测定。
4.计算:测定结果按下式计算
式中:C=从标准曲线上查得脯氨酸微克数;
V=提取液总体积(毫升);
a=测定时取用提取液毫升数;
W=样品干重(克),106=将克换算为微克。
分光光度计,分析天平,恒温水浴 ,研钵 ,容量瓶,具塞试管,移液管,漏斗,滤纸
具塞试管:25毫升9支
移液管:2毫升4支,5毫升2支
二、试剂
1.酸性茚三酮:称取2.5克茚三酮,加入60毫升冰醋酸和40毫升6 M 磷酸,于70℃下加热溶解。冷却后贮于棕色试剂瓶中备用。4℃下2~3日内有效。
2.脯氨酸标准溶液:称取0.0250克脯氨酸,溶解在250毫升蒸馏水中,其浓度为100微克/毫升。再取此液10毫升,用蒸馏水稀释至100毫升,即为10微克/毫升之脯氨酸标准液。
3.冰醋酸
4.甲苯
若用磺基水杨酸提取,需要配制3%的磺基水杨酸溶液。(若用酒精提取,需要80%的酒精,活性炭,人造沸石)。
三、材料
生长在灌水及干旱条件下的小麦或其它作物。
四、方法步骤
1.制作标准曲线:取7支25毫升具塞试管,编号。分别向各管准确加入 脯氨酸标准液(每毫升含脯氨酸10微克)0,0.2,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0毫升,再用蒸馏水将体积补至2毫升,摇匀,便配成了分别含0,2,4,8,12,16,20微克脯氨酸的标准系列。再向各管加入冰醋酸和酸性茚三酮各2毫升。摇匀后,在沸水浴中加热显色30分钟,取出后冷却至室温,向各管加入5毫升甲苯,充分摇动,以萃取红色产物。萃取完后(避光静置4小时以上),待完全分层后,用吸管吸取甲苯层,用分光光度计在520n M 波长下测定消光值,以脯氨酸含量为横座标,消光值为纵座标,绘制标准曲线。
2.游离脯氨酸提取:植物体内的游离脯氨酸可以用3%的磺基水杨酸提取。磺基水杨酸提取:称取新鲜和萎蔫小麦叶片各0.5克,将称好的样品放入具塞试管中,加入5毫升3%的磺基水杨酸溶液,将试管浸入沸水浴中提取15分钟,过滤,滤液待测。
3.测定:吸取滤液2毫升于试管内,与标准浓度的脯氨酸系列溶液同法显色测定。
4.计算:测定结果按下式计算
式中:C=从标准曲线上查得脯氨酸微克数;
V=提取液总体积(毫升);
a=测定时取用提取液毫升数;
W=样品干重(克),106=将克换算为微克。
来源:丁香实验