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植物体内游离氨基酸总量的测定

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9016

一、原理

游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应,产生蓝紫色化合物,其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。

二、仪器设备

分光光度计;电子天平;容量瓶25ml或50ml 3个;漏斗(直径6厘米)3个、滤纸适量;20ml刻度试管 7支;移液管0.5ml 3支、5ml 1支;试管架;玻棒;吸耳球;剪刀;移液管架;橡皮筋、塑料薄膜(封试管口);吸水纸;擦镜纸适量;电炉;水浴锅(含铁丝筐)。

三、试剂

1. 3%茚三酮试剂

称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里,贮于棕色瓶中。此试剂应放在冷凉处,不宜久放,使用期约10天。

2. 氰酸盐缓冲液(按以下方法配制):

(1)NaCN贮备液0.01mol/L(490mg/L)。

(2)醋酸缓冲液:称360g醋酸钠(含三分子结晶水)溶于约300ml无氨蒸馏水中,加66.67ml冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L。

取溶液(1)20ml,用溶液(2)定容到1L。

3. 标准氨基酸

精确称取在80℃下烘干的亮氨酸13.1mg(或α-丙氨酸8.9mg)溶于10%的异丙醇中,并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度,混匀,即为1mmol/L的标准氨基酸贮备液,置冰箱中保存。为了制备工作液,可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合,此液浓度为0.5mmol/L,即1ml含氨基酸0.5μmol,或氨基氮7μg。

4. 95%乙醇;异丙醇(分析纯)。

四、操作步骤

1. 标准曲线的制作 取20ml刻度试管18支,按下表1加入各试剂。加完试剂后混匀,在100℃水浴中加热12min(加热时封口),取出在冷水中迅速冷却,立即于每管中加入5ml 95%乙醇,塞好塞子,猛摇试管,使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色,此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下测其光密度(以空白管为参比),以氨基酸浓度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出直线方程。

2. 样品提取 选取有代表性的植物叶片(或其它组织),洗净擦干,剪碎混匀,迅速称取0.10~0.20g(视氨基酸含量多少而定),共称3份,分别加入20ml刻度试管中,再加蒸馏水10ml盖塞(或系上塑料薄膜),置沸水浴中20min以提取游离氨基酸,到时取出在自来水中冷却,把上清液滤入25ml容量瓶中,之后再往试管中加5ml蒸馏水,置沸水浴上再加热10min,过滤并反复冲洗残渣,最后定容至刻度,摇匀。

3. 样品测定 另取4支洁净干燥的试管,其中3支分别加入0.5ml提取液,另一支加0.5ml蒸馏水,然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各0.5ml,加完试剂后盖塞,置沸水浴上加热12min,冷却后,再分别加5ml 95%乙醇,摇匀,以空白作参比,在波长570nm下测其光密度。

根据光密度查标准曲线(或用回归方程计算)即可求出提取液中氨基酸的浓度。

4. 计算

游离氨基酸含量

式中 C:由直线方程计算的值,即0.5ml试样中氨基酸的微摩尔数(μmol);

V:样品提取液经稀释后的总体积(ml);

W:样品重(g)。

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