印三酮法测脯氨酸含量中 ，配置100微克每毫升的脯氨酸溶液制作标准曲线是什么意思？怎么制作

标准曲线的制作

分别取0.3mmol/L

的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL

于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL

pH5.4，2mol/L

醋酸缓冲液；再加入1mL

茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min

后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。

以OD570nm

为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

标准曲线目的是设定一个标准样，以便在实际测量样本脯氨酸含量时能够快速准确应用数学曲线进行含量测定，制作方法即设置多组已知浓度的标准脯氨酸样本液进行茚三酮法测定，并在电脑中根据数据绘制曲线

标准曲线图：

1.在分析天平上准确称量25mg脯氨酸，将其倒入一个小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加入蒸馏水使体积达到刻度，然后每毫升标准溶液中含有100μg脯氨酸。

2.脯氨酸系列浓度的制备取6个50ml容量瓶，分别盛有0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0ml脯氨酸原液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，每瓶脯氨酸浓度分别为1， 2、3、4、5和6μg/ ml。

3.取6个试管，分别吸取2ml标准浓度的脯氨酸溶液，2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，然后在沸水浴中加热每支试管30min。

4.冷却后，向每个试管中准确加入4ml甲苯，摇动30S，静置一会儿，以便将所有颜料转移到甲苯溶液中。

5.用注射器将脯氨酸甲苯溶液从每个试管中轻轻吸入比色杯中。使用甲苯溶液作为空白对照，在520 nm波长下进行比色。

6.标准曲线的绘制：首先根据脯氨酸（X）的浓度求出吸光度值（Y）的回归方程，再根据回归方程绘制标准曲线，计算出脯氨酸的含量（μg）。 2ml测量溶液/ 2ml）。

样品测定：

1.脯氨酸的提取：在不同处理下准确称取每片待测植物叶片0.5g的重量，将其放入大试管中，然后向每支试管中加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，并在沸水中提取浸浴10min（在提取过程中经常摇动），冷却后，在干净的试管中过滤，滤液为脯氨酸的提取物。

2.将2ml提取物移入另一个带塞子的干净试管中，加入2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮试剂，并在沸水浴中加热30分钟，溶液呈红色。

3.冷却后，加入4ml甲苯，振摇30S，静置一会儿，将上层液体放入10ml离心管中，并以3000rpm离心5分钟。

4.用移液管在试管中轻轻吸收脯氨酸红色甲苯溶液的上层。将甲苯用作空白对照，并在分光光度计上在520nm的波长处测量比色法以获得吸光度值。

标准曲线图：

1.在分析天平上准确称量25mg脯氨酸，将其倒入一个小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加入蒸馏水使体积达到刻度，然后每毫升标准溶液中含有100μg脯氨酸。

2.脯氨酸系列浓度的制备取6个50ml容量瓶，分别盛有0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0ml脯氨酸原液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，每瓶脯氨酸浓度分别为1， 2、3、4、5和6μg/ ml。

3.取6个试管，分别吸取2ml标准浓度的脯氨酸溶液，2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，然后在沸水浴中加热每支试管30min。

4.冷却后，向每个试管中准确加入4ml甲苯，摇动30S，静置一会儿，以便将所有颜料转移到甲苯溶液中。

5.用注射器将脯氨酸甲苯溶液从每个试管中轻轻吸入比色杯中。使用甲苯溶液作为空白对照，在520 nm波长下进行比色。

6.标准曲线的绘制：首先根据脯氨酸（X）的浓度求出吸光度值（Y）的回归方程，再根据回归方程绘制标准曲线，计算出脯氨酸的含量（μg）。 2ml测量溶液/ 2ml）。

样品测定：

1.脯氨酸的提取：在不同处理下准确称取每片待测植物叶片0.5g的重量，将其放入大试管中，然后向每支试管中加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，并在沸水中提取浸浴10min（在提取过程中经常摇动），冷却后，在干净的试管中过滤，滤液为脯氨酸的提取物。

2.将2ml提取物移入另一个带塞子的干净试管中，加入2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮试剂，并在沸水浴中加热30分钟，溶液呈红色。

3.冷却后，加入4ml甲苯，振摇30S，静置一会儿，将上层液体放入10ml离心管中，并以3000rpm离心5分钟。

4.用移液管在试管中轻轻吸收脯氨酸红色甲苯溶液的上层。将甲苯用作空白对照，并在分光光度计上在520nm的波长处测量比色法以获得吸光度值。

1.在分析天平上准确称量25mg脯氨酸，将其倒入一个小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加入蒸馏水使体积达到刻度，然后每毫升标准溶液中含有100μg脯氨酸。

2.脯氨酸系列浓度的制备取6个50ml容量瓶，分别盛有0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0ml脯氨酸原液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，每瓶脯氨酸浓度分别为1， 2、3、4、5和6μg/ ml。

标准曲线是为了后续测出OD值兑换成对应的你需要的组间浓度，标准曲线根据标准液体稀释成不同的浓度梯度制备。后续只需要检测OD值就可以知道浓度了。