考马斯亮蓝法测蛋白含量：标准曲线制作

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一、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

(一)、试剂：

1、考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)H3PO4。

2、标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

(二)、器材：

1、722S型分光光度计 使用及原理()。

2、移液管使用()。

(三)、标准曲线制作：

1、

试管编号	0	1	2	3	4	5	6
100ug/ml标准蛋白（ml）	0.0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6
0.15mol/L NaCl （ml）	1	0.9	0.8	0.7	0.6	0.5	0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml）	5	5	5	5	5	5	5
摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm	&NBS p;	&NBS p;	&NBS p;	&NBS p;

2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug)，在坐标轴上绘制标准曲线。

1)、利用标准曲线查出回归方程。

2)、用公式计算回归方程。

3)、或用origin作图 ，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6

一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4)、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

(四)、蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内)，依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

(五)、注意事项：

1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

对照：用被测物质以外的物质作空白对照。