流式检测细胞内游离钙离子

Fluo-3-Am为一新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，可以灵敏地反映细胞内游离钙离子浓度的变化，Fluo-3-Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶的Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。

具体如下：

1、钙荧光探针负载：取细胞悬液，加Fluo-3-Am至10μmol/L，置二氧化碳培养箱中孵育1h，其间轻微振荡3次。离心，去掉多余的染料。再用无钙缓冲液反复洗涤3次，最后用无钙缓冲液稀释。

2、随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为F值。

3、加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1mmol/L氯化钙，吹打均匀，孵育1~10min，测定荧光即Fmax值。

4、加入EDTA，20μl（钙螯合剂），孵育1~10min，激发波长488nm测定荧光，即Fmin值。加0.1％triton是增加膜通透性，使细胞外Ca2＋进入细胞内，作为最大值。加EGTA是为了螯合Ca2＋，作为最小值生理环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液（大约1：10000），细胞膜对钙的通透性变化对细胞内钙影响很大流式细胞术是一种高灵敏度的自动分析细胞的高新技术，快速而大量地检测单个细胞是它的一大特点。用流式细胞术可以摈弃原子吸收光谱法测定组织钙不能区别细胞内外Ca2+含量之不足，也不似其他方法操作过于繁杂。由于流式细胞术一次测量细胞数量大，故测定结果较为准确，误差小。更由于在活的细胞中进行测定，极有助于生命科学中Ca2+的研究。

但在测定过程中应注意以下几点：

1、实验器皿选用不析Ca2+的塑料制品，所用试剂选用超纯水配制，以减少本底误差。

2、严格控制细胞浓度：细胞浓度太大，容易阻塞仪器；细胞浓度太小，浪费试剂。

3、本实验除去细胞碎片极为关键。在低速洗涤细胞时，速度应从严掌握。流式细胞术所用细胞总量并不大，碎片过多，易造成仪器计数困难，也为划定测量区域造成困难。