如何确定转基因拷贝数

鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得 T 0 代转基因植物。在转化过程中，外源 DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。

一、Southern Blot法

Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。

其原理是将待测的 DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。

二、荧光定量PCR方法

利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。荧光定量 PCR 技术具有简便、快捷的优点，能够有效扩增低拷贝的靶片段DNA ，对每克样品中20 pg-10 ng的转基因成分进行有效检测。同时，与Southern法相比，荧光定量PCR技术可对T-DNA 的不同序列进行扩增，因此能实现对品系中的基因重组的检测。

选择一种合适的阳性标准品来绘制标准曲线，是应用实时荧光定量 PCR 技术准确定量模板初始浓度的基础。近年来，国内外的科学家做了不同的尝试。Song（2002）等认为理想的标准品应该是已插入外源基因的植物基因组DNA ，并且用Southern blot准确测得插入的外源基因拷贝数。但是在实际研究中，很难得到这样一套标准品。因此，他提出替代方案，根据外源基因拷贝数和野生型植物 DNA 的大小，按一定浓度比率混合，制成标准曲线。例如，在玉米的外源基因拷贝数研究中他们发现，在加入荧光染料SYBR GREEN I的20 μL PCR反应体系中，应以6 ng野生型玉米基因组DNA 作为模板量。已知玉米基因组DNA 大小为2.5 × 10.9 bp（Armuganathan和Earle 1999），相应于6 ng的玉米DNA ，即可计算出模拟1、2、4、8、16个外源基因拷贝时，应加入的质粒 DNA 的量。

以这些梯度混合液作为标准品，就可绘制标准曲线，检测样品的浓度并计算插入的拷贝数了。实验表明，用这种方法获得的数据和 Southern blot 的结果相当一致。Giovanna（2002）将农杆菌介导的转基因番茄作为研究材料，选择了双元载体T-DNA 区上的两个外源基因TSWV-N（Tomato spotted wilt virus）、nptⅡ（neomycin phosphoril-transferaseⅡ）和一个单拷贝的内源基因（endogenous gene）作为荧光定量PCR扩增的模板，检测外源基因拷贝数。他认为使用植物基因组 DNA 和一定比例质粒的混合液作为标准品，会累积许多无法避免的误差。比如使用这种标准品必需预先知道待测植物基因组 DNA 的精确分子量，并对植物 DNA 和质粒准确定量，但在大多数情况下得到的数据都只是近似值，再以此混合液作为标准品检测每一植株的外源基因拷贝数时，就会放大这些误差。

因此，他提出“相对CT”或“δ-δCT”的方法，这个方法的优点是不需要为每次实验制作标准曲线，只需要一个优化步骤证明外源基因与内源基因有相同的，至少是相似的反应效率即可。与其它定量技术如 Southern Blot 相比，实时定量 PCR 技术的特异性和高信嗓比特性为转基因拷贝数定量提供了一些方便。与实时定量 PCR 相比，DNA 点杂交技术要花费不菲的试剂、劳力以及时间。每个条带至少需要2微克的 DNA 用于放射性检测或是至少 10 微克用于荧光检测，因此，需要大量的组织样品，实验必须等到每个植株经过传代能够提供足够数量的组织后才可以用于检测拷贝数。

如果存在重组的话，结果将更为复杂。定量PCR分析的转基因拷贝数稍高于Southern Blot的分析结果，主要原因是Southern Blot方法在同一个插入位点有多拷贝的T-DNA 片段插入时，转基因植株的在完全酶切时会产生相似的DNA 片段，电泳分析时很难分辨清楚。定量PCR方法则完全避免了这种情况的发生，除非目的基因DNA 片段在PCR引物处发生断裂。两种方法分析结果的比较显示定量PCR方法分析拷贝数更加有效、适用。