western blot样品处理及保存

一、实验步骤

1、悬浮细胞样品
把细胞及培养液一起收集到15 ml或者50 ml离心管中，1 500 rpm离心3 min，弃去上清；加入10 ml 冷PBS轻轻吹打，1 500 rpm，4℃离心3 min，弃去上清；反复2次；第二次弃去上清后，用1 ml 冷PBS重悬细胞，移入1.5 ml微型离心管，2 500 rpm（500 g），4℃离心5分钟，尽量去除所有残留上清，于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况下，一般保存1年，建议尽快检测。

2、贴壁细胞样品

2.1 胰酶消化
用胰酶将细胞消化后，含血清的培养基中和胰酶，吹打，收集到15 ml或者50 ml离心管中，1 500 rpm离心3 min，弃去上清；加入10 ml 冷PBS轻轻吹打，1 500 rpm，4℃离心3 min，弃去上清；反复2次；第二次弃去上清后，用1 ml 冷PBS重悬细胞，移入1.5 ml微型离心管，2 500 rpm（500 g），4℃离心5分钟，尽量去除所有残留上清，于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况下，一般保存1年，建议尽快检测。

2.2 细胞刮子收集细胞
对于某些蛋白（即对胰酶比较敏感或者实验特殊要求，如E-Cadherin不易用胰酶消化后进行WB检测），直接用细胞刮子刮下细胞，连同培养基收集到15 ml或者50 ml离心管中，1 500 rpm离心3 min，弃去上清；加入10 ml 冷PBS轻轻吹打，1 500 rpm，4℃离心3 min，弃去上清；反复2次；第二次弃去上清后，用1 ml 冷PBS重悬细胞，移入1.5ml微型离心管，2 500 rpm（500 g），4℃离心5分钟，尽量去除所有残留上清，于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况下，一般保存1年，建议尽快检测。

3、动物组织样品
取下合适的动物或者人的组织样品后用预冷的PBS或者生理盐水漂洗，尽量除尽残留血液，用滤纸把多余PBS吸取干净。把组织分成约50mg大小（依据实验目的需要进行调整），用锡纸分别包装好或者用冻存管装好，于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年，建议尽快检测。

4、植物样品
取得待测植物样品后，用蒸馏水把泥土漂洗干净，用滤纸把多余水分吸取干净，分装成合适大小于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年，建议尽快检测。

5、细菌样品
细菌培养完成后，10 000rpm离心5 min收集细菌，加入PBS吹打，10 000rpm离心5 min，弃去上清；反复3次，弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。

6、若要检测磷酸化蛋白，请在3个月内进行。长时间保存样品容易使磷酸化蛋白去磷酸化而检测不到磷酸化条带。

7、提取胞浆、胞核蛋白的样品应尽量采用新鲜样品，因为冻存会使细胞浆、细胞核破裂。

8、血液样品（血浆中蛋白）：3 000 rpm离心20 min后收集上清，分装后于-80度或者液氮冻存待用。3个月以内检测。

二、注意事项

1、在细胞样品的处理时，一开始的PBS洗涤只是为了去除残留在培养液中的蛋白，所以，此时最好用预热的PBS，而不是冷的PBS，前者能保持细胞目前的生理生化状态，而后者会对细胞进行低温刺激，时间过长的话，会对细胞内的蛋白表达造成一定的影响。

2、在贴壁细胞用细胞刮刀处理时，最好现用预热的PBS清洗去除培养液中的蛋白，再加入少量冷的PBS后，用细胞刮刀刮取细胞。因为，在刮取过程中，有些细胞会破裂，细胞内的蛋白酶会释放出来，导致蛋白的降解，如果这时能保持低温，能有效的抑制蛋白酶的作用。当然，这时候如果是用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液就会更好了。

3、WB用的蛋白都是彻底变性的，因此不用考虑保持蛋白的活性或空间结构等，因此样品收集后，应尽快裂解并对总蛋白进行定量，然后加入loading buffer，放入－80℃保存。否则即使在－80℃下保存，细胞内的蛋白水平也会发生变化，等你用的时候可能里面的蛋白都不一样了。如果不信，你可以看看，刚从液氮中复苏出来的细胞状态和培养中的细胞状态差异有多大你就知道了，而这些差异都是蛋白水平的变化造成的。

4、最后一点，样品处理对WB来说至关重要。我曾经试过，将同一种细胞，先后培养，处理6次，才终于把抗体检测出来。