ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤

一、实验目的

1、深入了解ELISA 法测定抗体效价的原理。

2、掌握ELISA 法测定单克隆抗体效价的方法。

二、实验原理

ELISA 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA 法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA 法中。酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。

目前常用的几种ELISA 方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。

三、仪器、原料和试剂

仪器

聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。

原料

单克隆抗体

试剂

1、 抗原及酶标记抗体

①抗原：兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG，Code No．A0423)；

②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP，Code No．P0260)；均为DAKO 公司产品，使用时按照说明书要求稀释。

4、 洗涤液(含0.05％Tween 20的PBS)：1LPBS 中加入Tween-20 500μL.

5、 封闭液(含1％牛血清白蛋白，0.1％Tween 20的PBS)：10mLPBS 中加入100mgBSA，10μLTween-20.

6、 底物溶液

①磷酸钠盐缓冲液(0.1mol/LpH6.0)：称Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O 6.84g，用蒸馏水溶解，定容至500mL.

② TMB 贮液：称60mgTMB 溶于10mL 二甲基亚砜中，4℃避光保存。

③底物应用液：现用现配，磷酸钠缓冲液10mL，TNB 贮液10μL.30％H2O2 15μL，混匀。

7、 终止液：2mol/LH2SO4

四、操作步骤

①抗原包被：兔抗人IgG 作为抗原，用包被液l：8000稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜。

②洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。

③封闭：加l00μL/孔封闭液，室温放置0.5h.

④洗涤：用洗涤液洗3次。

⑤加待测样品(一抗)：将含单克降抗体的细胞培养上清在另-块板上用PBS 连续稀释(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，PBS 或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。加盖37℃恒温箱温育1~2h.

⑥洗涤：用洗涤液洗3次。

⑦加酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP，用封闭液l ：8000稀释，100μL／孔，加盖37℃恒温箱温育1h。

⑧洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。

⑨显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5～30min，显示蓝色。

⑩终止反应、比色：加50μL/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm 处各孔的吸光值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。