离子交换色谱

基本原理

离子交换色谱是将离子交换基因（CM、SP、Q、DEAE等）键合于一定的惰性载体（纤维素、交联葡聚糖，交联琼脂糖等）之上，并以此作为固定相，依据样品所带电荷的不同，从而与固定相上的离子交换基团相互作用的程度不同而进行分离的一种色谱方法。离子交换色谱技术已广泛用于蛋白质、多肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖等的纯化。

离子交换剂是在载体上键合了一些离子交换基团，而离子交换基团在水溶液中通过电离释放出游离的离子，这些离子可带正电或带负电，可以被溶液中的其它带相同电荷的离子取代，并对离子交换剂有较强的结合力。结合力的大小不仅受离子与离子交换剂之间作用力的影响，而且主要受离子浓度的影响，这个过程中的作用力是静电引力，离子交换的原理是静电相互作用。

蛋白质在离子交换色谱上的保留时间取决于蛋白质在相应色谱条件下所带静电荷的多少，而蛋白质所带静电荷的多少是由蛋白质分子的pI和所处溶液环境的pH共同决定的。在酸性条件下，蛋白质带正电荷；在碱性条件下，蛋白质带负电荷。在阳离子交换柱上，只有pI大于流动相pH的蛋白质在柱子上保留，而pI小于或等于流动相pH的蛋白质不保留，即使它们的pI值彼此之间有差异，也都作为溶剂峰同时被直接冲洗出来。而被保留的蛋白质出峰顺序则是pI小的先出峰，pI大的后出峰。在阴离子交换柱上情况则恰恰相反。

离子交换色谱过程分为四个阶段：平衡-吸附-解吸附-再生，其中吸附和解吸附是主要阶段，现以纯化TNF过程中应用的Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF为例说明。

试剂的配制

1，配制pH8.5 20mmol/L Tris-HCl含1mmol/L EDTA溶液（或其贮备液，临用时稀释即可）滤后使用。

2，配制pH7.5 20mmol/L的PB缓冲液，过滤后使用。

操作步骤

1，样品的预处理

2，样品的平衡

将实验一中50%饱水硫酸铵沉淀、离心得到的上清液，置于透析袋中，于20～40倍体积的pH8.5 20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA的缓冲液中，4℃搅拌透析24h，中间换透析液3～4次，4℃ 12000rpm离心15min，收集上清，测定蛋白浓度，记录体积。

3，阴离子柱Q-Sepharose FF的平衡及上样

取阴离子交换基质Q-Sepharose FF装柱，柱体积5.4×20cm用pH8.5 20mmol/L Tris-HCl 1mmol/L EDTA 缓冲液流洗平衡层析柱，调整好蛋白检测仪的量程及记录仪灵敏度。将收集的上清液以8ml/min流速上样。平衡缓液冲直至流出液吸光值恢复至基线。收集穿过峰，量体积，测蛋白含量。

4，洗脱

洗脱液A为pH8.5 20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA缓冲液，洗脱液B为含终浓度为1mol/L NaCl的A液进行线性梯度洗脱（根据纯化条件设定的纯化工艺），收集各洗脱峰量体积，测蛋白浓度，进行SDS-PAGE或进行活性鉴定TNF所在峰。

5，将活性峰用pH7.5 20mmol/L PB透析24h，中间换液3次。离心，取上清并量其体积，测蛋白浓度。

6，阳离子柱SP-Sepharose FF的平衡及上样

取阳离子交换基质SP-Sepharose FF装柱，柱体积2.5×10cm，用pH7.5 20mmol/L PB缓冲液流洗平衡层析柱，调整好蛋白检测仪的量程及记录仪的灵敏度，将透析、离心后的TNF的峰液以4ml/min的流速上样，用平衡液洗至基线，收集穿过峰，量体积，测蛋白浓度。

7，洗脱

阳离子层析柱SP-Sepharose FF的洗脱液A为pH7.5 20mmol/L PB，洗脱液B为含1mol/L NaCl的A液进行线性梯度洗脱，收集各洗脱峰，量体积，测蛋白质浓度，进行SDS-PAGE或活性鉴定。

8，后处理

进行TNF的纯度、活性等鉴定，按要求分装加赋形剂冷冻干燥后制成一定效价的TNF产品。

附 离子交换剂的选择

1，剂型的选择

在决定选择离子交换剂的类别之前，先要了解所研究的生物大分子保持生物活性和可溶解性的pH范围，然后根据其等电点以及其在上述pH范围内的电泳行为观察大分子的带电情况，再据此选择合适的离子交换剂。具体方法是；在流动相pH条件下进行电泳，向阳极泳动的蛋白质，可被阴离子交换剂吸附，因此，选择阴离子交换色谱；反之，向阴极泳动的蛋白质，可被阳离子交换剂吸附，应选择阳离子交换色谱。

通常，弱离子交换剂用来分离高静电作用力的蛋白质，强离子交换剂用来分离低静电作用力的蛋白质。

2，粒度的选择

离子交换剂粒度的大小对吸附量的影响不大，主要是对分辨率和流速产生影响。用粗颗粒填料填充的柱子不紧密，颗粒间隙大，容易引起区带扩散；由于颗粒大，同样吸附量的粗颗粒占柱床体积大，使形成的峰变宽。这些都会导致色谱分辨率下降。但是颗粒大流速快，分离速度快，使纯化时间缩短。细颗粒填料可填充成为致密的吸附床，分辨率高，但流速慢，柱压高。我们可根据自己工作的需要进行选择，如果为保持欲分离组分的生物学活性需要缩短分离时间，在大量制备基因工程产品时，可选用粗颗粒。如果要得到高分辨率，可选用超细颗粒。通常我们在实验室工作中采用的是细或中等粗细的颗粒。

3，缓冲液的选择

在离子交换色谱中，选择合适的缓冲体系，保持准确的流动相pH值更显得尤为关键。选择缓冲液时应满足以下要求：
（1）不破坏蛋白质的结构，不影响蛋白的活性。
（2）对人体无毒无害。
（3）缓冲容量大，在所选择pH范围内有足够缓冲能力的前提下，离子浓度越小越好。
（4）使用阳离子交换时应用阴离子缓冲剂，使用阴离子交换时应用阳离子缓冲剂，以避免不必要的离子交换过程。
（5）不干扰对分离物的鉴定。

目前阳离子交换色谱常用缓冲液离子有烷基胺、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑、Tris，吡啶等，其中Tris最为常用；阴离子交换色谱常用的缓冲液离子有醋酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸，磷酸盐等，其中醋酸盐和磷酸盐最为常用。

在实际工作中，我们根据不同的流动相 pH条件来决定采用何种缓冲体系。例如：流动相pH3-5时，我们采用甲酸铵缓冲液；流动相pH4-6时，我们采用醋酸钠或醋酸钾缓冲液；流动相pH6-8时，我们采用磷酸钠或磷酸钾缓冲液。此外，Tris-盐酸缓冲液的pH范围为7-9，Tris-磷酸缓冲液的pH范围为6-9，我们都经常选用。

4，洗脱方式的选择,

离子交换色谱洗脱方式有三种：一是改变缓冲液pH，使蛋白质从吸附状态变为解吸附状态。如在阴离子交换色谱中，通过降低流动相pH使吸附在柱子上的带负电荷的蛋白质带正电，从而达到解吸附，在阳离子交换色谱中则是通过升高流动相pH的方法达到解吸附；二是增加缓冲液的离子强度，将吸附强的分子从离子交换剂上替换下来；三是缓冲液pH和离子强度同时改变。无论哪一种方法，都可用阶段洗脱和梯度洗脱两种方式进行。

 

阶段洗脱是用几个不同pH缓冲液或几个不同盐浓度的缓冲液逐步进行洗脱。即pH和离子强度变化不连续。而在梯度洗脱中，缓冲液的洗脱能力是连续增加的，由于后者分辨率更好，因此被广泛采用。

 

在经典色谱中需用梯度混合器来制造线性梯度，梯度混合器是由两个容器构成，两个容器安放在同一个水平上，一个盛起始缓冲液，另一个盛含较高离子强度或不同pH的缓冲液。二者用管子相连，以保持溶液的流体静力平衡。当缓冲液从第一个容器流入柱内，第二个容器的缓冲液进入第一个容器自动补足，使缓冲液形成梯度。

 

现在许多中低压色谱仪器（如Waters，Pharmacia等公司的一些产品）和高效液相色谱一样可以用计算机控制双泵自动配制流动相，很容易地获得直线或非直线、连续或非连续的梯度模式，以满足不同的分离需要。

 

通常对线性梯度的要求是：
（1）洗脱液的总体积应足够大，一般梯度至少要四倍床体积，使分离的各个峰有较好的分辨率；
（2）梯度上限要有足够强的洗脱能力，使吸附的最紧密的物质也能够从柱子上被洗脱下来；
（3）梯度的斜率不应太大，以确保各峰能够分开，但又不应太小，以免峰形过宽甚至形成拖尾；一般认为，梯度体积越大，梯度变化越缓，则分辨率越好。

 

实验操作

1．填料的预处理

2．装柱

离子交换色谱不同于凝胶色谱，柱子通常较为短小，对于一般工作，通常选长度为10-40cm的柱已足够。柱的直径按照欲分物质的数量来选定。对于很复杂的混合物和进行精细分析是用细长的柱，分辨率较好；对于初步分离可用较粗、容量较大的柱。装好的柱子用起始缓冲液充分平衡后上样。

3．上样

离子交换色谱柱必须充分平衡后方可上样。上样量取决于色谱柱的交换容量，一般为交换容量的70-80%，上样体积可以不受限制。通常低浓度样品上样可达床体积的几倍到几百倍。这一点对较稀的样品极为有利，可以同时起到分离和浓缩的双重作用，可谓一举两得。但用于分析时，为了提高分辨率，上样量体积适当减小。用于离子交换色谱分离的样品溶液的离子强度和pH值必须与起始缓冲液（即流动相A液）一致，如不一致，应进行缓冲液转换，可通过透析或凝胶色谱来完成。

4．洗脱、样品收集

加样后用足够量的起始缓冲液洗涤除去不吸附的物质，然后再进行洗脱。洗脱可选择不同的方法，用控制器或梯度混合器控制梯度。流出的样品组分经紫外检测器实时检测（检测波长一般为280nm），用分部收集器或手工收集。

5．再生

样品洗脱完毕后要进行再生，以除去仍然结合在柱子上未完全洗下的一些蛋白质，通常用100%流动相B液再洗脱1个柱体积即可。

6. 平衡

再生后的柱子欲再次进样需重新进行平衡，平衡一般用100%A液（即0%B液）洗涤柱子至少四个柱体积。

7．保存

柱子不用时应用强洗脱剂洗去结合于柱子上的杂质，然后再用蒸馏水彻底清洗后加抑菌剂保存。