实时荧光PCR检测技术

众所周知，PCR（聚合酶链反应）技术自从1985年问世以来，经过十几年的发展，已成为实验室的常规技术。它是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。相比于传统的临床诊断方法，核酸诊断是分子水平上的诊断技术，可以弥补传统临床诊断方法的某些缺陷，比如，核酸诊断能直接揭示病原体的存在，能客观反映病原体在人体内感染及活动情况，可以作为临床治疗中的一个有效监控手段，另外采用核酸诊断技术还可以检测到常规检测方法难以检测到的病原体，例如可以克服酶免检测技术中从感染到抗体产生的窗口期问题。因此，以PCR技术为代表的核酸诊断技术在临床诊断中得到日益广泛的应用。

传统的PCR检测模式

传统的PCR检测模式一般需要三个步骤：1.首先需要对待测标本进行处理：通过裂解、纯化，提取标本中的病原体核酸（DNA或RNA）作为PCR扩增的模板；2. 采用PCR或RT-PCR技术对提取到的病原体核酸进行扩增；3.检测PCR扩增产物，检测方法包括凝胶电泳和类似于酶免反应的PCR-ELISA等。

实时荧光PCR检测技术

近年来，PCR技术有了重大改进。将传统PCR检测模式中的PCR扩增和检测相结合（即在同一个密闭容器中将PCR扩增反应与荧光标记探针检测结合在一起）检测目的核酸的检验方法纷纷出台。这样的检测方法称为“实时”PCR，表示PCR扩增产物可被实时检测。准确地说，“实时”是指在每一个PCR循环后检测扩增产物，当PCR扩增反应结束后，我们可以得到每个样品的PCR扩增产物变化曲线。通过分析这些反应曲线，不但可以得到病原体的定性检测结果，还可以对病原体的数量进行精确定量。

实时荧光PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于应用了荧光探针，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。而实时荧光-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端从而可以快速以及动态地检测PCR扩增产物并减少外来核酸造成的污染。

实时荧光PCR技术基于荧光共振能量迁移（FRET，Fluorescent Resonance Energy Transfer）原理：当两个荧光基团靠近时，高能量荧光基团会将受激发产生的能量转移到相临的低能量荧光基团上。由于标记在探针上的两种荧光基团所发出荧光信号的变化可以反映PCR扩增产物的数量变化，从而使得荧光PCR技术可以起到实时检测的目的。目前，根据荧光基团在寡核苷酸探针上的不同标记形式，各种荧光PCR检测试剂盒所采用的荧光探针基本可以分为三种类型：Taqman探针、分子信标和荧光杂交探针

表1: Taqman探针、分子信标和荧光杂交探针的特点比较

荧光探针类型	Taqman探针	分子信标	荧光杂交探针
探针形式	单条探针	1条具有发夹结构的探针	2条相临的探针
荧光标记	5’端标记发光基团 3’端标记淬灭基团	5’端标记发光基团 3’端标记淬灭基团	1条探针的3’端标记激发基团相临探针的5’端标记发光基团
荧光检测原理	PCR反应延伸时，探针被Taq酶切断，检测脱离于淬灭基团控制的发光基团所发出的荧光信号	探针和模板结合，发夹结构被打开，检测远离淬灭基团控制的发光基团所发出的荧光信号	2条相临的探针同时和摸板结合，检测发光基团受相临的激发基团激发而产生的荧光信号
常用发光基团	FAM，TET，VIC，HEX	FAM Texas Red	LC-Red640， LC-Red705

采用实时荧光PCR技术需要具备集PCR扩增和荧光检测于一体的荧光PCR扩增仪, 目前临床中普遍使用的荧光PCR仪主要有ABI公司的5700型荧光PCR仪、Roche公司的LightCycler和BioRad公司的iCycler。三种仪器的特点比较见表2。

表2 ：三种荧光PCR仪的特点比较

荧光PCR仪	5700	LightCycler	iCycler
可检测荧光信号	单波长	3种波长	1-4种波长
样品数	96	32	96
PCR反应时间	2-3小时	30分钟	1-2小时
在线观察	不可以	可以	可以
荧光探针形式	Taqman 探针	Taqman 探针 分子信标 荧光杂交探针	Taqman 探针 分子信标 荧光杂交探针

实时荧光PCR检测技术的优势

与普通PCR模式相比，实时荧光PCR具备几个方面的优势：

1、由于实时荧光PCR采用封闭的检测模式，因此扩增产物导致污染的可能性比普通PCR要小得多。

2、由于扩增产物的检测在PCR扩增过程中同时进行，并且数据的采集、分析全部由仪器自动完成，因此整个检测所需的时间比普通PCR要节省许多。

3、实时荧光PCR检测模式功能强大，具备定性、定量、突变、多项目等检测功能。而普通PCR要完成上述项目需采用不同的技术平台。

4、实时荧光PCR进行定量检测时，其定量线性范围（5-6 logs）比普通PCR（2-3 logs）要宽得多。

随着反应试剂、仪器和操作的不断发展和完善，以实时荧光PCR技术为核心的检测试剂盒纷纷问世，逐步趋向于灵敏特异、快速精确和自动化。当然，由于成本较高，操作难度大，目前在临床疾病的诊断和治疗上还未得到普及。因此，如何进一步提高检测方法灵敏度、简化操作程序、缩短检测时间、消除非特异因素干扰以及采用统一的、标准化的方法已成为实时荧光PCR检测试剂盒未来研究的主要方向。许多研究者趋向于将更多的精力投入实时荧光定量PCR方法的研究开发，使之进一步合理化，以增加试验的可信度；通过使其涉及的所有过程实现最终自动化，来提高临床检验结果的准确性。毫无疑问，在不久的将来，实时荧光定量PCR技术将以其显著的优势，在分子生物学、实验医学，特别是在临床医学领域中得到越来越广泛的应用。