细胞爬片免疫组化染色操作步骤
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- 1. 取出细胞爬片,迅速置入冷丙酮固定 20~30 分钟。
2. 蒸馏水浸泡 5 分钟,2 次。
3. 打孔液浸泡 5 分钟。
4. 蒸馏水浸泡 5 分钟,2 次。
注:第 3、4 步仅用于检测细胞内抗原,检测细胞膜抗原时不用。
5. 正常血清封闭:从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗体同源动物血清)处理,37 ℃,15 分钟。
附:正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制):按 1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按 50 μl+5 μl (10%抛洒量) 计算。
6. 滴加第一抗体:用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加第一抗体,37 ℃ 2 小时(也可置于 4 ℃冰箱过夜) 。
7. PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。
8. 滴加生物素化的二抗,37℃,40 分钟。
9. PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。
10. 滴加三抗 (SAB 复合物) ,37 ℃,40 分钟。
11. PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。
12. DAB 显色,镜下观察,适时终止(自来水冲终止) 。
附:DAB 的配制储备液(DAB 25 mg/ml)的配制:DAB 250 mg + PBS 10 ml,待完全溶解后分装成 1 ml,100 μl,50 μl ,20 μl 等,-20 ℃,冻存。② 工作液:DAB 储备液 20 μl + PBS 1000 μl + 3% H2O2 5 μl。
13. 自来水(细水)充分冲洗。
14. 苏木素复染,室温,30 秒,自来水冲洗。
15. 自来水冲洗返蓝,15 分钟。
16. 梯度酒精脱水:80%,2 分钟 95%,2 分钟 100%,2 次,5 分钟。
17. 二甲苯透明:I ,II (二甲苯)各 5 分钟
18. 封片:加拿大树胶(或中性树胶)封片