细胞爬片的免疫组化染色

1. 取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定 20~30 分钟。

2. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

3. 打孔液浸泡 5 分钟。

4. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

注：第 3、4 步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。

5. 正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 （保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清 （与第二抗 体 同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。

附：正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。

6. 滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时（也可置于 4℃冰箱过夜） 。

7. PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

8. 滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。

9. PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

10. 滴加三抗 （SAB 复合物） ，37℃，40 分钟。

11. PBS：5 分钟，2 次（置于摇床） 。

12. DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止） 。

附：DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml，100μl，50μl ，20μ l 等，-20℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

13. 自来水（细水）充分冲洗。

14. 苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。

15. 自来水冲洗返蓝，15 分钟。

16. 梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。

17. 二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分钟

18. 封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。