细胞固定、染色原理与方法

一、固定与固定液

固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。

1. 目的

（1）迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。

（2）使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。

（3）使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。

（4）使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。

（5）防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。

2. 时期

（1）有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。

（2）减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。

小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4 cm，花药长度大致在1-2 mm左右，黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。

玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10-15 cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5 mm，花药尚未变黄时取材。

蚕豆：从现蕾开始，上午10-11点可选取2-3 mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。

3. 固定时的注意事项

（1）固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。

（2）选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。

（3）固定的时间要合适：
与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。

经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4 ℃冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。

固定液：固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好，而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液，如卡诺氏固定液等。

1. 固定液的条件

（1）迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。

（2）必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。

（3）尽可能避免使组织膨胀或收缩。

（4）使细胞内的成分凝固或沉淀。

（5）增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。

（6）增加媒染作用和染色能力。

（7）使组织变硬，具有一定的硬度。

（8）固定以后能起到保存的作用。

（9）在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不致于因以后的处理而使固定的原生质变形。

2. 常用的几种固定液

（1）酒精：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。酒精固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20%左右)，可使材料变硬。酒精常用于混合固定液中，但由于它本身是一种还原剂，很容易氧化成乙醛，甚至氧化成醋酸，因此最好不与三氧化铬、重铬酸钾及锇酸等氧化剂配合使用。但与甲醛、醋酸或丙酸配合，用作固定效果很好。酒精能溶解脂肪及凝脂，故不宜用来固定脂类材料。

（2）甲醛水溶液：甲醛在水中的溶解度为37-40%，渗透力强，固定均匀，对组织收缩作用小，一般用于固定大材料。市售溶液中含量下降，因形成三聚甲醛而失效。

（3）冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.3-0.5%的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。

（4）AF液：90 ml乙醇+10 ml甲醛 用于固定大块组织。

（5）卡诺氏固定液： 冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6
改良卡诺氏固定液: 冰醋酸:无水乙醇=1:3

二、染色与染色原理

根据染料的来源不同可分为天然染料(苏木精、洋红等)和人工合成染料（煤焦油染料，如碱性品红等）。

1. 苯与苯的取代物

苯醌(红色) 苯酚 三硝基苯

2. 染料的分子结构

呈酸或碱性，溶于水，可电离，可与材料结合