HepG2细胞培养的相关条件

HepG2人肝肿瘤细胞株广泛应用于遗传毒理学及病毒培养等方面的研究,研究肝脏疾病发病机理及其临床应用有着重要意义。由于其与肝细胞具有相同的生物学活性，还被用于胰岛素抵抗的研究。本文对肝癌细胞培养的最佳条件做一简单综述。

1、HepG2细胞的复苏条件

（1）复苏温度的选择

唐孟萱[1]等采用下述方法进行细胞复苏：快速将所冻存细胞40℃水浴摇床60转/ min慢摇至其溶解，溶解后马上转入 37 ℃水浴箱，手工慢摇恒温 2～3min复苏 ,复苏后 800 转/ min 离心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培养基 ,混匀后加入细胞培养板 ,每孔 1 ml，5%CO2温箱 37℃培养。唐孟萱等将上述方法与细胞专著[2]所述方法相比较，传统 37 ℃水浴方法复苏后细胞存活率为 68.4%，先 40 ℃溶解后 37 ℃恒温方法复苏后细胞存活率为 85.7%。证明其所用方法优于传统方法。

（2）复苏用培养基的选择

钟志宏[3]等使用培养基培养基RPMI-1640和DMEM两种培养基对HepG2细胞进行培养，结果发现，用DMEM培养基培养的细胞结果在接种密度为1×104/cm2、血清含量为15%时，经6h培养后细胞开始贴壁，12h后大部分细胞贴壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例传代。而用RPMI-1640培养基培养的细胞在接种密度为1×104/cm2、血清含量为20%时，时，经6h培养后细胞贴壁不明显，但12h后部分细胞贴壁，24h后亦大部分细胞贴壁，且增值速度相对较慢，5天后可以按1:3的比例进行传代。以上结果说明，使用DMEM培养基既可以节省血清，细胞贴壁所用时间短、增殖速度快，并且传代细胞培养也使用DMEM培养基，使用DMEM培养基进行复苏，避免了配制不同培养基所带来的麻烦，因此在HepG2细胞复苏中推荐使用DMEM培养基。

（3）复苏时的接种密度

甘起霓[4]等研究发现当接种密度为1×104/cm2，血清含量为20%时, 细胞24 后大部分贴壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例传代；当接种密度大于1×104/ cm2和（或）血清含量少于20%时, 细胞表现为贴壁困难, 出现进行性退化; 当接种密度小于1×104/ cm2 血清含量为20%时, 细胞24h后大部分贴壁, 但增殖速度明显减慢, 约7d后才可按1:3比例传代。

2、消化酶及消化时间的选择

唐孟萱[1]等研究发现，EDTA+胰酶的消化能力太强，消化时间不好把握，传代消化后细胞死亡较多；EDTA消化能力太弱，消化时间太长且不易将细胞消化完全;用PBS将细胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆盖细胞约30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min，显微镜下可观察到细胞消化适度。钟志宏[3]等将待传代细胞不用PBS洗涤和用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后分别用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液进行消化（消化液用量为盖满瓶底），观察时间为30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟。结果发现：不用PBS洗涤的细胞分别用上述两种酶消化，10分钟后细胞仍然消化不完全。用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后的细胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化时，分别经3分钟、1分钟和0.5分钟能完全消化好细胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液进行消化时，完全消化好细胞约需3分钟、1.5分钟、1分钟。二者的结果相符。根据上述结果可知，在进行HepG2细胞的消化时，先用pH7.2的PBS洗涤三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分钟效果比较好。费洪新[5]等人则推荐使用如下方法进行消化：果明显，对细胞的影响小。一般适宜的消化方法是：用1×PBS将细胞洗涤2次 再加入适量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的体积比混合）覆盖细胞约20秒后吸去胰蛋白酶 （含有0.02%EDTA并以7：3的体积比混合）。

3、培养基中血清浓度的选择

由于人肝癌 细胞株生长缓慢，恶性程度较高，对于血清的要求比较严格，其培养时所需要胎牛血清的浓度要比一般的肿瘤细胞高一些。些经验，费洪新[5]等人认为在含15%胎牛血清的DMEM培养基中HepG2人肝癌细胞生长迅速。钟志宏[3]、王爽[6]等人的实验结果也支持上述结果。甘起霓[4]则认为血清含量为20%时, HepG2细胞贴壁后增殖速度最快。当HepG2细胞增殖数代后, 待其状态稳定时, 可将血清含量逐渐降至10%。唐孟萱[1]等人则认为12%的血清浓度足以满足HepG2细胞的生长。

4、双抗浓度的选择

王爽[6]等通过正交实验优选发现，双抗浓度为0.5%时传代效果较好，条件易于控制，且细胞能顺利生长。

6、培养基pH条件的选择

钟志宏[3]等人实验发现复苏细胞和传代细胞在pH6.8-7.4、5%CO2条件下培养，其贴壁和增值速度无明显变化。而无CO2条件下培养时，复苏细胞在不同pH值条件下均表现为培养液逐渐变碱性，细胞不能贴壁，且逐渐缩小，退化；传代细胞在不同pH值条件下培养，其培养液逐渐变酸性,当pH值﹥7.0时，经24h培养后，细胞基本贴壁，但增值缓慢，经48h培养后大部分细胞已伸出伪足，细胞数量明显增多；当pH值﹤7.0时，细胞贴壁困难，经72h培养后，细胞缩小、呈退化趋势。王爽[6]等通过正交实验优选发现，pH7.2时传代效果较好，条件易于控制，且细胞能顺利生长，与上述结果相符。

7、细胞传代条件的选择

王爽[6]等通过正交实验对HepG2细胞的传代条件进行优选，他推荐在细胞汇合度达95%-1000%时进行传代。唐孟萱[1]等人的研究结果表明HepG2 细胞生长至汇合度50%～95%时是对数生长期,死细胞相对较少;而当汇合度达到 100%时 ,生长趋于平台期 ,死细胞数开始增加;特别是汇合度 100%以后再继续培养,死细胞数明显增加而活细胞数减少。据此可确定 HepG2 细胞培养最佳的传代时期是在汇合度 95%～100%之间。二者的实验结果相符，推荐在汇合度在95%-100%时进行细胞传代。