流式CBA方法--检测大鼠细胞因子实验方案
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1. 实验所需试剂
1.1 RAT IFN-GMA CBA FLEX SET （558305）
规格：100TST
组成：Rat IFN-γ 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IFN-γ PE 检测二抗试剂，Rat IFN-γ捕捉微球（定位：A6）
1.2 RAT IL-10 CBA FLEX SET （558306）
规格：100TST
组成：Rat IL-10 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-10 PE 检测二抗试剂，Rat IL-10捕捉微球（定位：A8）
1.3 RAT IL-6 CBA FLEX SET （558308）
规格：100TST
组成：Rat IL-6 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-6 PE 检测二抗试剂，Rat IL-6捕捉微球（定位：A9）
1.4 RAT TNF CBA FLEX SET （558309）
规格：100TST
组成：Rat TNF 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat TNF PE 检测二抗试剂，Rat TNF捕捉微球（定位：C8）
1.5 Rat IL-1a Flex Set (560159)
规格：100TST
组成：Rat IL-1a标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-1a PE 检测二抗试剂，Rat IL-1a捕捉微球（定位： A4）
1.6 Rat IL-2 Flex Set (561420)
规格：100TST
组成：Rat IL-2标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-2 PE 检测二抗试剂，Rat IL-2捕捉微球（定位：Bead E5）
1.7 Rat IL-4 Flex Set (558307)
规格：100TST
组成：Rat IL-4标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-4 PE 检测二抗试剂，Rat IL-4捕捉微球（定位：Bead B9）
1.8 BD Cytometric Bead Array(CBA) Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kit(558266)
| Reagent | Quantity(558266) |
| Assay Diluent | 1 bottle, 30 mL |
| Capture Bead Diluent | 1 bottle, 5 mL |
| Detection Reagent Diluent | 1 bottle, 5 mL |
| Wash Buffer | 1 bottle, 130 mL |
| Instrument Setup Bead A1 | 1 vial, 0.25 mL |
| Instrument Setup Bead A9 | 1 vial, 0.25 mL |
| Instrument Setup Bead F1 | 1 vial, 1.0 mL |
| Instrument Setup Bead F9 | 1 vial, 0.25 mL |
| PE Instrument Setup Bead F1 | 1 vial, 0.25 mL |
| PE Positive Control Detector | 1 vial, 0.5 mL |
2. 实验操作步骤：
2.1准备Rat Soluble Protein Flex Set标准品
（Rat Soluble Protein Flex Set标准品为干粉状态，与检测试剂混合前首先应该重新稀释。）
2.1.1 打开即将用于检测对应细胞因子标准品瓶子，将所有干粉转移到15ml流式上样管中，用4ml Assay Diluent溶液稀释重悬，此管标记为TOP Standard，室温静止15min。
2.1.2 然后取9根管子，分别标记为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128和1:256；每根管子加入500ulAssay Diluent稀释液，按照下图依次转移500ul到下一管，完成梯度稀释。
2.1.3 最后取根管标记为0pg/ml，只加入500ulAssay Diluent稀释液。
2.1.4 最终实现如下表格的浓度梯度。
| Dilution tube | |||||||||
| Rat Soluble Proteim Flex Sex | Top Standard | 1:2 | 1: 4 | 1:8 | 1:16 | 1: 32 | 1: 64 | 1:128 | 1:256 |
| Protein (pg/mL) | 10,000 | 5,000 | 2,500 | 1,250 | 625 | 312.5 | 156 | 80 | 40 |
2.2 混合Rat Soluble Protein Flex Set捕捉微球（捕捉微球为50倍浓度保存，使用前应稀释为最佳反应浓度）
2.2.1 按照实验要求，每种微球单次检测母液量为1ul，公式为：总体积=捕捉微球种类数1uundefined检测样本数+（捕捉微球种类数1uundefined检测样本数49）
2.2.2 将稀释好的捕捉微球标记为“Mixed Capture Beads”待用，不能长时间储存。
2.2.3 稀释待测样本：大鼠标准品覆盖范围为40 to 10,000 pg/mL，如果预测待测样本浓度过大，需对其进行稀释。实验者根据样品预测浓度，选择合适的稀释比例，也可以使用多个稀释比例摸索一个最佳稀释量；稀释缓冲液为Assay Diluent。大鼠血清和血浆一般要求稀释4倍以上。
2.3准备大鼠Protein Flex Set检测试剂
大鼠PE检测试剂为50倍浓缩试剂，加入检测管前要确保此时检测试剂终浓度为50稀释，单次反应量为1ul。（注此过程需避光）
公式为：需要加入的Detection Reagent Diluent稀释液=反应次数50ul~F反应次数1ul。
2.4标准品以及样品上机前处理步骤
2.4.1加入50ul大鼠Soluble Protein Flex Set Standard 稀释液到10个流式管里，
| Well label | Standard dilution | Mouse Conc (pg/mL) | Rat Conc (pg/mL) |
| 1 | no standard dilution (Assay Diluent only) |
0 (negative control) |
0 (negative control) |
| 2 | 1:256 | 10 | 40 |
| 3 | 1:158 | 20 | 80 |
| 4 | 1:64 | 40 | 156 |
| 5 | 1:32 | 80 | 312.5 |
| 6 | 1:16 | 156 | 625 |
| 7 | 1:8 | 312.5 | 1,250 |
| 8 | 1:4 | 625 | 2,500 |
| 9 | 1:2 | 1,250 | 5,000 |
| 10 | Top Standard | 2,500 | 10,000 |
