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流式细胞仪检测细胞内因子

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最新修订时间：

材料与仪器

离心机、流式细胞仪、玻璃管、塑料管、培养的细胞、外周血单个核细胞、固定剂、破膜剂、染色缓冲液、PBS缓冲液、细胞裂解液、小牛血清、无水乙醇、封闭抗体如FcII/III受体的抗体（CD16/32）、用荧光标记的抗细胞因子抗体；

步骤

基本方案——细胞内因子的荧光标记

材料与步骤：

经过激活、固定、冻 存 的 细 胞 （见辅助方案1〜3) n/ PBS-S V PBS-S/牛奶 荧光标记的抗细胞因子抗体（直接标记用，如 H T C -偶联的抗IFN- 7 和 PE-偶联的 抗 IL-4; B.D.Bioscience 公司， B. Pharmingen 公 司 ， Caltag， Biosource 公 司） 同型对照 VPBS/BSA 37°C 水浴 突光标记用的4ml V 形 底 试 管 （Sarstedt) I. 37°C 水 浴 复 苏 已 经 活 化 、固 定 的 冻 存 细 胞 。加 入 Iml PBS-S 于 每 个 样 品 ，转移 2 X 106个细胞至4ml V 形底试管
2. 4°C ， 1500g 离心 lOmin。弃上清。 3 . 加 入 50M1 的 PBS-S/牛奶，上下颠倒试管重悬细胞。冰上孵育30miri。 4 . 将细胞分到试管中， 4°C ， 1 5 0 0g 离 心 lOmin。弃上清。 每 4 X 1 0 6个 经 佛 波 醇 豆 葱 酸 乙 酸 盐 （P M A )-离 子 霉 素 （ionom ycin) 活 化 的 细 胞 可 以 分 成 4 〜 8 份 样 品 ，而 一 支 同 样 数 量 的 经 抗 原 活 化 的 细 胞 仅 能 分 成 2 份 样 品 。 5 . 准备抗体混合物，即 用 PBS-S/牛奶 稀 释 到 合 适 浓 度 （每种抗体的浓度通常为0.5〜 2. 5|ug/ml)。加 入 50jul的抗体混合物于每个试管，反复敲打管壁混合细胞。对于每 份样品，制备同型抗体对照。 6 . 避光， 4°C 孵 育 30min。 7 . 加 入 I m l 的 PBS-S 于每个试管，振荡。 4°C ， 1500g 离 心 lOmin。弃上清。敲打管底 弹开细胞。 8 . 重复步骤7 。 9 . 用 300〜600^1的 PBS/B S A 重悬细胞。在 24h 内进行流式细胞仪分析。根据活化的 细胞类型和阳性细胞的期望频率，确定获取的细胞数量。

辅 助 方 案 1—— PMA 和 ionomyciii 激 活 T 细胞

材料与步骤：

n/ R P M I -10完全培养基， 37°C 溶于1 0 0 % 乙醇的200Mg/m l 佛波醇豆蔻酸乙酸盐（P M A ) ，保存在一 20°C 。 溶于二 甲 基 亚 砜 （D M S O ) 的 10mmol/L (7. 5m g /m l ) 的 离 子 霉 素 （ionomycin) (Ca2+ 盐），保存在一 2 0 °C 溶于 D M S O 的 10mg/ml 的 BrefeldinA (B F A ) ，保存在一20°C 溶于PBS (见附录 1 ) 的 3mg/ml 的 DNase I (60 OOODomase U /m l ; Calbiochem 公 司）；可选用 4m l 和 15ml V 形底试管 2 4 孔组织培养板 37°C ， 5 % C 0 2培养箱 细胞刮或移液管 1 . 准 备 P B M C (单元8. 1 0 ) 。 如果需要保留一段时间再进行检测，可以放置在 4 °C R P - M I -I O 培养基中过夜，浓 度 在 4 X 10 6〜2 0 X 1 0 6个细胞/m l 。 2 . 重悬细胞于37°C 预 热 的 R P M I -I O 培养基，浓 度 为 4 X 106个细胞/ml。接种细胞于24
孔组织培养板，每 孔 lml。 3 . 每 5m l 的 37°C 预 热 的 R P M I -10培 养 基 中 加 入 Im I 的200网/1111的P M A 、 IiU l 的 10mmol/L 的 ionomycin 和 IOjul 的 10mg/ml 的 B F A 。在 15〜30min 内使用，混勻。 警告：操 作 P M A 、 ionomycin、 B F A 时应戴手套。 4 . 加 入 I m l 的 培 养 基 于 每 孔 （含 浓 度 为 2 X 106个细胞/m l 的细胞， 20ng/m l的 P M A ， ljumol/L 的 ionomycin 和 l 〇 jug/ml 的 BFA)〇 也 可 以 刺 激 2X 107个 细 胞/IOml于 6 孔 板 或 者 4X 105个 细 胞 / 2 0 0 4 于 96 孔 板 。 5 . 于 37°C ， 5 % C 0 2培 养 箱 中 孵 育 6h 。该 培 养 时 间 适 合 于 IL- 4 和 IL- 5 , 对 于 IL-2 和 IFN-7 算是折中。 6•可选择操作：加 入 40jul的 3mg/ml DNase I 于 每 孔 （终 浓 度 为 3500Dornase U /ml) ， 37°C 孵育 5min。 7 . 用细胞刮或者移液管处理贴壁细胞。转 移 细 胞 至 4ml V 形 底 试 管 。上下吹打细胞， 打散细胞团。 8. 4°C ， 300^离 心 lOmin，固 定 细 胞 （见 辅 助 方 案 3)。如果待测的细胞表面标志对多 聚甲醛固定剂敏感，在固定前遵照辅助方案4 进行标记。

辅 助 方 案 2——抗 原 活 化 T 细胞

材料与步骤：

R P M I -10完全培养基， 37°C 抗 C D 28 (人 ： B D Biosciences L 293 克 隆 、 B D Pharmingen 和 Beckman-CoulterC D 28.2 克隆、 Y T H 913.12 克隆；小鼠 ： BDPharmingen37.51 克隆） lOmg/m l 的热灭活结核菌素， H 37R a 菌 株 （B D Biosciences) 溶于 D M S O 的 10mg/ml 的 BrefeldinA (B F A ) ，保存在一20°C 溶于PBS (见附录 1 ) 的 3mg/ml 的 DNase I (60 OOODornase U /m l ; Calbiochem 公 司）；可选择溶于P B S 的 0. lmol/L 的 E D T A 16m m X 125m m 的聚苯乙燦培养管（Corning公司） 37°C ， 5 % C 0 2培养箱 4m l 聚丙烯或者厚壁聚丙烯V 形底试管 1 . 准 备 P B M C (单 元 8. 10)，重 悬 细 胞 于 37°C 预 热 的 R P M I -I O 完 全 培 养 基 ，浓度为 2 X 106个细胞/m l 。 2 . 加 入 抗 C D 2 8 至终浓度为I iU g A n U 吹打混匀。转 移 2m l 细 胞 于 16m m X 125m m 的圆 底聚苯乙烯组织培养试管。 3 . 加 入 lOmg/m l 的热灭活结核菌素至终浓度10Mg/ml，混匀。最适抗原浓度应预先确定。 4 . 室温， 300^离 心 5min。拧松管帽，直立放置37°C ， 5 % C 0 2培养箱中孵育2h 。 5 . 用 R P M I -I O 完全培养基稀释10m g /m l 的 B F A 至 ZQOjug/ml (1 : 5 0 稀释）。轻轻地
加 入 IOOiUl到 每 支 试 管 （终浓度为10Mg/ml) ，不要扰动细胞沉淀。 37°C 孵 育 4h 。 最 佳 的 终 止 时 间 和 条 件 需 要 预 先 确 定 。 6•可选择操作：加 入 40M1的 3m g /m l D N a s e I 于 每 孔 （终 浓 度 为 3500D 〇m a s e U /ml)， 37°C 孵育 5min。 7 . 加 入 20〇 4的 0. Imol/L E D T A 于每孔，室 温 孵 育 5min。上下吹打贴壁细胞，小心 避免气泡产生。转移细胞至4ml V 形底试管。 8. 4°C ， 300g 离 心 lOmin，固 定 细 胞 （见 辅 助 方 案 3)。如果待测的细胞表面标志对多 聚甲醛固定剂敏感，在固定前遵照辅助方案4 进行标记

辅 助 方 案 3——固定和 冻存 PBMC

材料与步骤：

4 % (m A O 多 聚 甲 醛 （P F A ) 活化的P B M C (见辅助方案1 或 2 ) 或者活化的表面标记细胞（见辅助方案4) V P B S , 4°C V P B S /B S A , 4°C 10 % (V /T ) 试剂级 D M S O , 于 P B S ， 4°C 4m l 聚苯乙烯V 形底试管 2m l 冻存管 1 . 溶 化 4 % P F A 于 37°C 水 浴 IOmin。振荡溶解任何可见沉淀。 2 . 转移活化的P B M C 至 4m l 聚 苯 乙 烯 V 形底试管， 4°C ， 300g 离 心 lOmin。弃上清， 勿扰动细胞沉淀。敲打试管底部，打散细胞团块。 3 . 加 入 I m l 冰 冷 P B S ，振荡混匀。 4°C ， 300g 离 心 lOmin。弃上清。敲打试管底部，打 散细胞团块。 4 . 加 入 500/xl的预温的4 % P F A ，室温孵育5min，定时振荡细胞，避免细胞成团。 5•加入2m l 冰 冷 PBS/B S A ，混匀。 4°C ， 1500g•离心5min。弃上清。 6 , 重悬细胞沉淀于0.5m l 的 1 0 % D M S O /P B S 。分 装 4 X 106个细胞至2m l 冻存管。可在 一 80°C 保 存 1〜2 年

辅 助 方 案 4——PBMC 的细胞表面标记

材料与步骤：

待标记的活化细胞（见辅助方案1 或 2) V P B S /B S A , 40C P E -Cy5 或 PerCP/C y 5. 5 偶联的抗人 C D 4 单 抗 （Sigma， B D Biosciences， Caltag) 或其他感兴趣的抗细胞因子单抗 V P B S , 4°C 4ml V 形 底 聚 苯 乙 燦 试 管 （Sarstedt) 血细胞计数板 注意：所有清洗和孵育过程在冰上操作以减少细胞内因子的分泌。
1•转移活化细胞至4m l V 形底聚苯乙烯试管， 4°C ， 300g 离 心 lOmin。弃上清。敲打试 管底部，打散细胞沉淀。 2 . 重悬细胞于I m l 的冰冷PBS/B S A 。用血细胞计数板计数细胞。 3•分装4 X 106个细胞至合适数量的4m l V 形底试管。 4°C 、 300g 离 心 lOmin。弃上清。 4 . 准备荧光素偶联的C D 4 单抗于2 0 0 4 的 P B S /B S A ，至期望浓度。单抗放置于冰上。 5 . 加 入 200M1 的单抗于细胞沉淀，反复吹打重悬细胞。避光冰浴20m i n 。 6 . 加 入 Iml的冰冷PBS，温和振荡。 4°C ， 300g 离 心 lOmin。弃上清。敲打管底弹开细胞。 7 . 按照辅助方案3 的步骤4〜6 完成清洗和固定

辅 助 方 案 5——用荧光标记的抗细胞因子抗体标记活化细胞内的细胞因子

材料与步骤：

未偶联荧光的和F I T C 偶联的抗IFN-7单抗 未偶联荧光的和P E 偶联的抗IL-4单抗 未偶联荧光的和A P C 偶联的抗IL-2单抗 未偶联荧光无关同型对照抗体（与每种抗细胞因子抗体匹配） 注意：所 有 以 上 抗 体 可 从 B D Biosceinces， B D Pharmingen， Caltag， Biosource， R & D Systems 和 eBiosceince 获得。 1 . 准备并用PBS-S/牛奶封闭 的 细 胞 （见基本方案步骤1〜3)。将细胞分成2 份 25M1体 积 于 2 支 4m l 试管。 4°C ， 1500g 离 心 lOmin。弃上清。 2 . 用 5 0 M 1 PBS-S/牛奶含有 lOO^ g / m l 的未偶联荧光特异性抗IFN-7、抗 IL-4和 抗 IL-2 单抗的混合物重悬细胞。在第二管，用 5 0 M 1 PBS-S/牛 奶 含 有 IOOiU gA n l与每个特异 性细胞因子抗体同型的未标记抗体混合物重悬细胞。 3 . 如果添加单抗使Saponin稀释至<0. 0 6 % ，加入所加抗体1/10体积的10X Saponin。 4. 4°C 孵育 lh。 5 . 在所有管中加入F I T C 标记的抗IFN-7 单 抗 、 P E 标 记 的 抗 IL-4单 抗 和 A P C 标记的 抗 IL-2单抗至合适浓度。 4°C避光孵育30m i n 。 6 . 清洗和进行流式细胞仪分析见基本方案步骤7〜9。
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来源：丁香实验

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