免疫胶体金电镜染色方法

免疫胶体金电镜染色亦可分包埋前和包埋后两种染色方法，前者因标记抗体对细胞膜的穿透性较差，故仅适于细胞表面抗原的显示，而后者较常用于对细胞内抗原的显示。现分别介绍如下：

一、包埋后染色

1. 常规包埋或低温包埋的组织标本按包埋后染色要求制作50一70nm超薄切片，切片载于镍网或金网上；

2. 经OsO₄ 后固定或环氧树脂包埋的组织，需用H₂O₂ 蚀刻。以增加抗体的通透性。方法：将1％H₂O₂ (数滴)滴于蜡板上。镍网的载切片面向下轻轻浮于液滴表面或置于液滴内，室温10分钟，低温包埋剂包埋的组织细胞可省略此步骤。

3. PBS漂洗3次，每次5～10分钟；

4. 正常羊血清(1:50)或1％BSA室温孵育20～30分钟；

5. 第一抗体孵育，可先置4℃，12～24小时，然后室温1小时，使抗体充分渗透并结合。

6. PBS漂洗同上；

7. 将载网置含1％BSA的PBS(pH 8.2)中，为胶体金标抗体的结合提供碱性环境：

8. 胶体金标记的第二抗体(1：50，以pH 8.2的PBS稀释)。室温孵育20―30分钟；

9. 双蒸水洗3次，每次5分钟

如进行双标记免疫染色，则用PBS漂洗，重复步骤③一⑦；

10. 直接或经电子染色后进行电镜观察，方法与常规电镜操作相同。

二、包埋前染色

1. 将冰冻组织切片贴于涂抹黏附剂的载玻片上。培养细胞经离心后可制成涂片，冰冻组织切片也可进行漂浮染色。

2. PBS漂洗及染色程序与包埋后染色步骤基本相同。第一抗体的孵育时间可适当延长，一般先置4℃，24―48小时，再室温孵育1～3小时。染色后，最好用1％OsO₄ 后固定30～60分钟，以提高固定效果，增强电子密度。然后按照常规电镜标本制作方法进行系列乙醇或丙酮脱水、包埋、超薄切片及电子染色等处理。