免疫胶体金技术介绍

一、免疫胶体金技术的基本知识

1、胶体金的概念

氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

2、免疫金标记技术

胶体金颗粒表面负电荷与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。胶体金对蛋白质有很强的吸附功能，蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面，无共价键形成，标记后大分子物质活性不发生改变。

3、胶体金的示踪原理

金颗粒具有高电子密度的特性。金标蛋白在相应的配体处大量聚集时，在显微镜下可见黑褐色颗粒或肉眼可见红色或粉红色斑点。

免疫金银染色：利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，通过银颗粒的沉积，在光镜下可见抗原抗体反应的阳性部位呈现银的黑褐色。

二、胶体金的制备

1、胶体金制备的注意事项

（1）玻璃容器的清洁：玻璃容器应绝对清洁，用前酸洗、硅化。

（2）试剂、水质：实验用水一般用双蒸水。缓冲液有足够大的缓冲容量，浓度不应过高以免金溶胶自凝。

2、常用方法

一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、白磷。

（1）柠檬酸三钠还原法：

取0.01％氯金酸水溶液100 ml加热至沸，搅动下准确加入１％柠檬酸三钠水溶液0.7 ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535 nm，Ａ1 cm/535 nm=1.12。

100 ml氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响：

１％柠檬酸三钠（ml ）0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00

金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙

吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518

径粒(nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15

（2）柠檬酸三钠－鞣酸混合还原剂：改变鞣酸的加入量，制得不同大小的胶体颗粒。

（3）白磷还原法：制备的胶体金直径约6 nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。

三、免疫胶体金的制备

1、制备胶体金标记蛋白质应注意的问题

（1）蛋白质的预处理。蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成分。用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。

（2）低盐浓度的缓冲液。过量盐可使金颗粒发生凝集。

（3）PH接近于蛋白质等电点或略偏碱性。蛋白质所处溶解状态最适合偶联，蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。

（4）蛋白质最适用量的选择：能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。

（5）胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂，以避免产生凝集。一般选用PEG（分子量为20000）和牛血清白蛋白作稳定剂。

2、常见方法

（1）用0.1 mol/L K2CO3或0.1 mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。

（2）加入最佳标记量的蛋白质溶液，搅拌2～3分钟。

（3）加入5 ml 1％PEG20000 溶液。

（4）于10000～100000 g离心，小心吸去上清液。

（5）将沉淀悬浮于一定的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以Ａ1 cm/540 nm=1.5左右为宜，置4 ℃保存。

四、免疫胶体金的应用

1、胶体金在光镜水平、电镜水平的应用

直径为3～15 nm胶体金均可用作电镜水平的标记物。最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒进行双重或多重标记。

胶体金用于光镜水平、电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织切片中抗原的检测。

2、胶体金在流式细胞仪中的应用

应用胶体金标记的抗体，分析细胞表面抗原。胶体金可以明显地改变红激光散射角，区分不同的标记，能同时进行几种标记。

3、凝集试验

单分散的免疫金溶胶清澈透明。与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒增大、沉降，光散射随之发生变化，溶液的颜色发生变化。

4、免疫印迹技术

用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，与特异性的抗体保温后，再与胶体金标记物温育，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。金免疫印迹技术有相当高的灵敏度。采用免疫金银染色法，灵敏度可低至0.1 ng。

5、胶体金在肉眼水平的应用--胶体金免疫结合试验