DEAE--52纤维素的处理
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关于DEAE52纤维素的处理只有简单的几步,如下: 2.再用0.5mol/l的HCl溶液浸泡2小时,用去离子水洗净至PH中性,并抽干; 3.将抽干的纤维素再浸泡在0.5mol/l的NaOH溶液中2小时,用去离子水洗至中性,抽干。即可用了 对于用过的纤维素,可以重复利用多次,但需要经过再生处理后才可以使用。再生处理可先用高浓度NaCl (1-2 mol/L)过柱冲洗柱床,以除去DEAE-52阴离子交换纤维所吸附的成份。然后,再用0.5 mol/L的HCl和NaOH处理,处理方法与预处理完全相同。 DEAE-纤维素的处理及装柱 (1)处理 本实验采用的是DEAE-纤维素DE 52 是弱酸型阴离子交换剂,具体处理方法为:先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中,去除杂质;再在0.5N的HCL溶液中浸泡1-2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上,并将其在抽滤漏斗中抽干;将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1-2h,再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。 (2)装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上,加1/3体积的无离子水,打开下出液口,水流畅通,即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材,轻轻倒入层析柱中,凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部,凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处,停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵,下出口连接蛋白质监测仪,待层析柱的平衡。 (3)平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡,所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液(洗脱液)置换出来,使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是:利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内,打开层析柱下端的出口,平衡液流速在0.5-1ml/min,当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时,层析柱达到了平衡。在本实验中,用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA),预先将DE-52柱进行平衡。 称取IgDEAE32或52,放入5ml量筒中,加蒸馏水浸泡过夜,观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量,称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜,其间换几次水,每次除去细小颗粒。抽干,改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上,抽干(可用布氏漏斗),用无离子水漂洗,使pH至8左右(用pH试纸检查)。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上,去酸溶液,用无离子水洗至pH6左右。本实验中在用前应以0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液,浸泡平衡后使用。 用过的离子交换剂可以反复使用,使其恢复原状的方法俗称“再生”。再生并非每次用酸、碱反复处理,通常只要“转型”处理即可。所谓转型就是使交换剂带上所希望的某种离子,如希望阳离子交换剂带上NH+4则可用NH4OH浸泡,如希望阴离子交换剂带上Cl—则用NaCl溶液处理。本实验中DEAE—纤维素在酸碱处理后,用0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型,以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由于DEAE—纤维素使用后因带有大量杂蛋白,所以再生时,先用0.5ml/L NaOH浸洗,用去离子水洗至pH8左右,再转型,即可再使用。 (责任编辑:大汉昆仑王) |